高分辨G带技术

一、原理

一般常作的G带技术在人类染色体的单倍体中仅能观察到320条带纹，这对于一些染色体细微结构异常的识别是不够的。近年来，用氨甲蝶呤等药物使细胞同步化，另加某些药物如胸腺嘧啶核苷、BrdU等阻止染色体收缩。

并用有丝分裂抑制剂秋水仙素或秋水酰胺低浓度短时间处理，结果就能得大量晚前期、前中期和早中期的有丝分裂图象。这样在人类染色体的单倍体带纹数可增加到400条、550条和850条，甚至可达1200~2000条之多。这对于进一步研究较细小的染色体缺陷和基因定位，具有重大意义。

1. 常规外周血培养54~56小时。

2. 同步化：同步化的药物可用氨甲蝶呤或胸腺嘧啶核苷。如用氨甲蝶呤，则加入上述已培养过的外周血中，使其最终浓度为10~7 M；如用胸腺嘧啶核苷则加入已培养过的外周血中，使其最终浓度达0.3 mg/ml。同步化需在加上述药物后再置于37℃中继续培养17小时。

3. 无菌（pH=7.0）Hank液在无菌室中洗去培养物中的残余药物。其方法是将同步化培养后的培养物在无菌室中先置于无菌离心管中用1000转/分，离心10分钟，吸去上清液培养液，加入无菌Hank液5~10 ml，用吸管打散沉淀底物细胞，然后按上述速度离心一次，吸去上清掖，留下底物，再洗涤细胞一次，如此反复洗涤细胞二次。

4. 新培养：最后一次洗涤细胞后，吸去上清液，将底物细胞移至另一新鲜的生长培养液中（内含有PHA，pH=7.0），此生长培养液同时还需加入下列物质：即先前如用氨甲蝶呤同步化，则此时应加入胸腺嘧啶核苷，使其最终浓度达到10~5 M；如先前用胸腺嘧啶核苷同步化，则此时应加入BrdU，使其最终浓度达10 μg/ml。然后置于37℃中继续培养6小时。

5. 阻止分裂：可用秋水仙素或秋水酰胺。如用秋水仙素则加入使其最终浓度为0.5 μg/ml；如用秋水酰胺则加入使其最终浓度0.05微克/毫升。再培养15~30分钟。

6. 低渗处理：用0.050 M KCl预温于37℃，加入后处理30分钟。继后按常规方法进行预固定、固定、离心和制片。

7. G显带：常用胰酶G显带法（GTG显带法），用低浓度胰酶（0.05%~0.01%）溶液处理标本20~60秒。

8. Giemsa染色：用1：20的Giemsa稀释液染色20分钟左右。

三、注意事项

1. 高分辨G带在制作过程中比较困难的就是染色体分散差、重叠多，不好作核型分析。因此采用的方法是增加固定次数（制片前固定三次），或用反固定（即用1份甲醇：3份冰醋酸），或置于冰箱中存放24小时后制片，或用高距离（滴管距玻片在1米以上）滴片，以促使分散均匀，少重叠。

2. 制片后作G显带一般时间不宜太长，此情况同于一般染色体G显带制作。

3. 在低浓度胰酶处理的时间亦需作一张试片，以确定以后显带最佳时间。

4. 在同步化培养的续培养中，如是加BrdU的话，则需进行暗培养，可用黑纸包扎或用暗纸盒盛放于培养箱中培养。

四、上述几种染色体显带技术的选用提示，见表一。

表一