【分享】荧光定量PCR问题解决方案

<center> <table> <tbody> <tr> <td> <center> 问题</center> </td> <td> <center> 可能原因</center> </td> <td> <center> 建议解决方法</center> </td> </tr> <tr> <td> 定量PCR 无扩增产量或很少的扩增产量</td> <td> DNA模板质量不好，含有抑制剂</td> <td> 提高模板质量，诸如DMSO，SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂，可以使用乙醇沉淀DNA</td> </tr> <tr> <td> PCR引物设计较差</td> <td> 避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。</td> </tr> <tr> <td> 探针设计较差</td> <td> 对探针序列进行blast比对，设计符合要求的探针</td> </tr> <tr> <td> PCR引物合成较差</td> <td> 用普通电泳法，看引物的设计和合成质量，是否有目的条带出现。</td> </tr> <tr> <td> 荧光探针无功能</td> <td> 确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。<br /> 用DNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强。<br /> 必要的话设计和合成探针。</td> </tr> <tr> <td> 模板浓度太低</td> <td> 使用10^4拷贝的靶序列，以在25到30个循环中获得信号。</td> </tr> <tr> <td> 镁离子浓度太低</td> <td> 从3mM到5mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。FQ-PCR MasterMix-UNG 试剂盒不需优化镁离子浓度。</td> </tr> <tr> <td> 引物浓度太低</td> <td> 最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度，在260nm测量光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。(见公式1)</td> </tr> <tr> <td> 选择优质酶进行扩增</td> <td> 选择hot start Taq酶进行扩增，可提高灵敏度，增加产量，降低干扰因素</td> </tr> <tr> <td> 退火温度太高</td> <td> 使用表4的公式估算Tm，把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值，所有真正的退火温度实际会高些或低些。</td> </tr> <tr> <td> 反应物中有不明物干扰</td> <td> 在各个反应物中存在不明物质对PCR进行干扰，对任何实验样品或试剂，均应采用无菌无酶无热源的离心管进行试剂的分装和使用。</td> </tr> <tr> <td> 定量PCR阳性对照无扩增曲线(针对：已经优化好的体系)</td> <td> 引物、探针设计合格；原来合成质量已经验证。需确认：</td> <td> 反应成分是否漏加；确定反应条件是否合适；<br /> 正常标本是否能扩增来判断是对照的问题还是体系的问题；<br /> 确认体系：1、引物是否降解(看扩增产物是否可电泳出)来判断引物和酶功能；2、探针是否降解(用DNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强)。</td> </tr> <tr> <td> 仪器是否正常工作</td> <td> </td> </tr> <tr> <td> 定量PCR阴性对照一直有扩增曲线</td> <td> 模板或PCR残余污染</td> <td> 隔离污染来源，更换试剂。<br /> 使用UNG/dUTP防污染系统。<br /> 使用专用的精致移液器。<br /> 在无DNA区域准备反应，使用抗气溶胶的吸头。</td> </tr> <tr> <td> 体系有问题</td> <td> 酶浓度不对，Mg离子浓度不对</td> </tr> <tr> <td> 定量PCR(染料法)出现非特异信号</td> <td> 引物二聚体多</td> <td> 检查引物设计和合成环节，必要时更改引物</td> </tr> <tr> <td> 更换热启动酶</td> <td> 热启动酶能增加反应的特异性，提高灵敏度</td> </tr> <tr> <td> 设定检测信号时的温度</td> <td> 在更高的温度下检测荧光信号(此时引物二聚体已经解链)</td> </tr> <tr> <td> 定量RT-PCR<br /> 无扩增产量<br /> 相对荧光信号小于等于背景或没有模板对照</td> <td> 无cDNA合成</td> <td> </td> </tr> <tr> <td> cDNA合成温度太高</td> <td> 降低保温温度</td> </tr> <tr> <td> 反转录cDNA产物被二级结构封闭</td> <td> 提高保温温度。重新设计引物</td> </tr> <tr> <td> RNA被损害或降解</td> <td> 必要的话更换RNA</td> </tr> <tr> <td> RNAse污染</td> <td> 维持无菌条件；加入RNase抑制剂</td> </tr> <tr> <td> 荧光探针无功能</td> <td> 确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。<br /> 用DNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强。<br /> 必要的话设计和合成探针。</td> </tr> <tr> <td> 灵敏度低<br /> 须在比预期更高的循环中检出产物(Ct滞后)</td> <td> 初始模板RNA不充分</td> <td> 增加模板RNA的浓度；使用10ng-1µg的总RNA</td> </tr> <tr> <td> RNA被损害和降解</td> <td> 必要的话更换RNA</td> </tr> <tr> <td> RNAse污染</td> <td> 维持无菌条件；加入RNase抑制剂</td> </tr> <tr> <td> 无效的cDNA</td> <td> 通过增加70％乙醇清洗的次数来去除制备RNA过程中的抑制剂</td> </tr> <tr> <td> 无效的PCR扩增</td> <td> 注意：反转录的抑制剂包括SDS、EDTA、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚精胺。<br /> 调整cDNA合成温度或引物设计</td> </tr> <tr> <td> 检测使用仪器</td> <td> 扩增仪温度检查和荧光仪器温度和信号检查，是整体滞后还是个别孔滞后</td> </tr> <tr> <td> PCR忠实性：PCR在产物序列中引入了错误</td> <td> 采用荧光探针法</td> <td> 增加结果特异性和产物的忠实性</td> </tr> <tr> <td> 循环数太多</td> <td> 降低循环数。</td> </tr> <tr> <td> 四种dNTP的浓度不同</td> <td> 制备新的dNTP混合物，保证四种核苷浓度相同。使用预混合物。</td> </tr> </tbody> </table></center>