PCR的相关技术介绍
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一、聚合酶链反应的历史回顾
1、核酸体外扩增最早的设想
由Khorana及其同事于1971年提出:“经过DNA变 性,与合适引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重视该过程便可克隆tRNA基 因”。但由于当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物,且当时(1970年)Smith等发现了 DNA限制性内切酶,使体外克隆基因成为可能,所以,使Khorana等的早期设想被人 们遗忘。
2、聚合酶链反应的发明
1985年,美国PE-Cetus公司的人类遗传研究室 Mullis等人才发明了具有划时代意义的聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR), 使人们梦寐以求的体外无限扩增核酸片段的愿望成为现实。
其原理类似于DNA的体内 复制,只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适条件。开始是使用大肠杆菌 DNA聚合酶Klenow片段来扩增人基因组中的特异片段。由于该酶不耐热,因此,每次 加热变性DNA后都要重新补加Klenow酶。
在操作多份标本时,这一过程耗时,费力, 且易出错。耐热DNA聚合酶的应用使得PCR反应更易于自动化,继而PE-Cetus公司推 出了第一台PCR热循环仪,使该技术的自动化成为现实。Mullis等因此项技术于1993年 获得诺贝尔奖金。
二、聚合酶链反应相关技术的发展
PCR及其相关技术的发展速度是惊人的。国际上分别于1988年和1990年在美国和 英国召开了第一届和第二届PCR技术专题研讨会。第一届会议主要讨论了PCR的应用 与技术本身的优化问题;第二届会议的主要议题是人类基因组计划与PCR的最新进 展。这充分体现了生物学家对PCR的重视。
三、其它扩增技术
与PCR及其相关技术发展的同时,新的扩增技术也不断诞生。这些技术各有利 弊,与PCR互为补充,有的可结合应用,共同构成了核酸体外扩增技术的大家族。我 们相信,随着分子生物学技术的发展,这一家族一定会再涌现出新成员。
其它体外核酸扩增技术(表)
技术 应用
转录依赖的扩增系统(TAS) 检测HIV
连接酶链反应(LCR) 检测点突变
自主序列复制(3SR)系统 研究RNA,临床应用、法医学等
链替代扩增(SDA) 检测、鉴定基因
Qβ复制酶系统 增加探针检测敏感性
循环探针反应 增加探针检测敏感性
连接酶链反应 (A)
连接酶链反应(Ligase chain reaction,LCR),是一种新的DNA体外扩增和检测 技术,主要用于点突变的研究及靶基因的扩增。是Backman 1997年为检出靶基因序列 中的点突变而设计发明,并申报了专利。
LCR的基本原理为利用DNA连接酶。特异地将双链DNA片段连接,经变性-退火-连 接三步骤反复循环,从而使靶基因序列大量扩增。
LCR的扩增效率与PCR相当,用耐热连接酶做LCR只用两个温度循环,94℃min变性 和65℃复性并连接,循环30次左右。其产物的检测也较方便灵敏。目前该方法主要用 点突变的研究与检测、微生物病原体的检测及定向诱变等,还可用于单碱基遗传病多 态性及单碱基遗传病的产物诊断,微生物的种型鉴定,癌基因的点突变研究等。
依赖核酸序列的扩增 (A)
依赖核酸序列的扩增(Nucleic acid sequence-based amplification,NASBA) ,又称自主序列复制系统(self-sustained sequence replication,3SR)或再生长 序列复制技术。1990年Guatelli等首先报道了这一技术。
NASBA主要用于RNA的扩增、检测及测序。
其基本方法为:将引物,标本加入扩增反应液,65℃1min使RNA分子二级结构打 开,降温至37℃加入逆转录酶,T7RNA聚合酶和RNase H,并在37℃反应1~1.5小时,其 产物经琼脂糖电泳,溴乙锭染色即可在紫外仪下看到条带。
NASBA的特点为操作简便,不需特殊仪器,不需温度循环。整个反应过程由三种 酶控制,循环次数少,忠实性高,其扩增效率高于PCR,特异性好。
转录依赖的扩增系统 (A)
转录依赖的扩增系统(Transcript-based amplification sytem,TAS),是 Kwen等人于1989年研究报道的,主要用于扩增RNA。
TAS的主要特点是扩增效率高,因为其RNA拷贝数呈10的指数方式增加,只需6个 循环靶序列的拷贝数就能达到2×106。它的另一个特点是特异性高,由于TAS只能进行 6次温度循环,错掺率低,加之用葡聚糖珠夹心杂交,因而特异性也高。
虽然本法有较高的特异性和敏感性,但其循环过程复杂,需重复加入逆转录酶和 T7RNA多聚酶,有待进一步研究。
Qβ复制酶反应 (A)
Kacian等于1972年首次报报Qβ复制酶(Q-beta replicase)催化RNA模板的自我 复制功能,它能在常温30min,将其天然模板MDV-1RNA扩增至109。1986年Chu等报道 用生物标记的靶序列特异性探针,可与亲和素联接的MDV-1RNA杂交,经洗脱未被结合 的MDV-1后,再加入Qβ复制酶,扩增复制MDV-1拷贝,然后用溴乙锭染色检测或用同 源性的第二探针杂交。
Qβ复制酶是一种RNA指导的RNA聚合酶,它有3个特点:①不需寡核苷酸引物的引 导就可启动RNA的合成。②能特异地识别RNA基因中由于分子内碱基配对而形成的特有 的RNA折叠结构。③在Qβ复制酶的天然模板MDV-1 RNA的非折叠结构区插入一短的 核酸序列不影响该酶的复制。 因而,如在此区插入核酸探针,则其序列照样可能被 Q β复制酶扩增。
1988年Lizardi等,将靶基因序列插进MDV-1质粒里,用T7RNA聚合酶催化转录 出MDV-1 RNA探针,这种RNA探针可与靶序列杂交,然后洗去非杂交的探针,加入Qβ 复制酶来扩增探针,被扩增的探针又可作为模板进行扩增,并呈指数递增。其产物 按上述两种方法进行检测。现在该技术又发展了夹心杂交法,分子开关和靶依赖的复 制等技术。
四、PCR技术的应用举例
研究:基因克隆;DNA测序;分析突变;基因重组与融合;鉴定与调控蛋白质结合DNA序列;转座子插入位点的绘图;检测基因的修饰;合成基因的构建;构建克隆 或表达载体;检测某基因的内切酶多态性
诊断:细菌(螺旋体、支原体、衣原体、分支杆菌、立克次氏体、白喉杆菌、致病大肠杆菌、痢疾杆菌、嗜水气单胞菌和艰难梭菌等);病毒(HTLV、HIV、HBV、 HPVS、EV、CMV、EBV、HSV,麻疹病毒、轮状病毒、细小病毒B19);寄生虫(疟疾 等);人遗传病(Lesh-Nyhan综合症、地贫、血友病、BMD、DMD、囊性纤维化等)
免疫学:HLA分裂;T细胞受体或抗体多样化的定性;自身免疫病基因作图;淋巴因子定量
人类基因组工程:用散布重复序列产生DNA标志;遗传图谱的构建(检测DNA、 多态性或精子绘图);物理图谱的构建;测序,表达图谱
法医:犯罪现场标本分析;HLA-DQ
肿瘤:胰癌、结肠癌、肺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、血液恶性肿瘤
组织和群体生物学:遗传聚类研究;动物保护研究;生态学;环境科学;实验遗 传学古生物学:考古与博物馆标本分析
动物学:动物传染病的诊断等
植物学:检测植物病原等