PCR相关技术

早在1958年科学家分离出DNA聚合酶（ polymerase）后，就曾设想利用DNA聚合酶扩增大量DNA片段。但当时由于DNA测序较难，没有核苷酸合成技术及耐热性的DNA聚合酶没有得到分离等原因而没有发展起来。

直到1985年，美国的Cetus人类 遗传实验室的年轻科学家Mullis在偶然灵感的启迪下发明了划时代的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）简称PCR技术----一种体外扩增特异DNA片段的技术。它是在模板、四种dNTPs及两种特异性引物存在的条件下耐热性TaqE的酶促聚合反应。

1983年，美国人类遗传研究室的K.B.Mullis以热变性的双链DNA分子为模板，利用引物和四种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）为原料在DNA聚合酶的作用下大量扩增了特定的DNA片段。PCR技术自其产生起就以简单和快速的特点而成为科研人员在分子生物学研究中常用且必备的一种手段。

在PCR反应中，由双链DNA高温变性，低温退火与适温延长三个步骤构成一个循环，理论上，经n次PCR循环后，目的DNA片段的分子数可以达到2n，而每一次循环则仅需要3min，正是因为PCR技术的快速、高量而使之持久不衰。

PCR反应分三步：

（1）高温变性（denaturation）：高温（通常94℃）变性双链模板DNA；

（2）退火（annealling）：当温度降低时，由于模板DNA结构较引物复杂得多，而且引物大大过量，使引物在与其互补的模板局部形成杂交双链，而模板DNA双链之间互补的机会较少；

（3）延伸（extention）：中温（72℃）下TaqE沿5`-3`方向催化以引物为起点的DNA链延伸反应。 三个步骤形成一个循环，多个循环组成PCR反应。每一个循环的产物可以作为下一循环的模板，数小时之后，介于两引物之间的特异DNA片段得到大量扩增，数量可达到106~7拷贝。

1、反应体系

(1) 引物长度

特异性一般通过引物长度和退火温度控制。如果PCR的退火温度设置在近于引物Tm 值 (引物/模板双链体的解链温度)n 度的范围内，18到24个碱基是最具特导性的。15个或更少碱基的寡核苷酸链只适用于有限数量的PCR 操作，如减法文库方法中使用的任意和随机引物。

根据生物基因组大小，最短长度仅在几个核苷酸范围内变动，最在特异性允许的范围内寻安全性。每增加一个核苷酸，引物特异性提高4倍,这样大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。显然，如果使用纯化的cDNA 或者不是基因组 DNA 的样品，由于非特异性引物－模板反应的危险大大降低，引物长度可以缩短。

然而，引物设计时使合成的寡核苷酸链 (18~24 mer) 适用于多种试验条件仍不失为明智之举；寡核苷酸链增加4到5个碱基所需的费用是会得到补偿的。引物长度的上限并不很重要，主要与反应效率有关。由于熵的原因，引物越短，它退火结合到靶 DNA 的稳定双链模板的速率越大。

一般来说，如果扩增有一定程度不均一性的序列，则需要28～35个碱基长的寡核苷酸作引物。可以及从不同物种中克隆另一物种已知序列的基因。在这种情况下，要首先使用引物设计软件来比较所有已知相关序列，并记述序列变异最少的DNA区域。

这时候，比较该家族中相关蛋白的功能活性关键区域的已知序列，有助于确定新引物设计应集中考虑的序列范围。应用已知结构数据从某一相关物种中对结构和功能类似的酶或受体进行PCR克隆。

根据氨基酸序列信息和不同物种使用的密码子表，两个引物或至少有一个引物可以围绕保守序列区域设计。在选择用来扩增来自不同物种DNA的引物时，应避开mDNA的5`和3`末端非翻译区序列，因为它们可能没有任何的同源性。引物3`末端的位置对于PCR的成功非常关键。

如果能确定一个保守氨基酸，可将其密码子的前2个碱基作为3`末端（若是单一密码子编码的氨基酸，如甲硫氨酸和色氨酸，则为3个碱基）。引物3`末端和模板的碱基完全配对对于获得好的结果是非常重要的，而引物3`末端最后5到6个核苷酸的错配应尽可能的少。

若有额外的序列信息要加到引物中，例如限制酶切位点，可以使用加长的引物。一般来说，引物5`端添加无关序列不会影响引物特意序列的退火。有时候，引物中添加了大量与模板不配对的碱基，可以在较低退火温度的条件下进行4到5个扩增循环，然后计算得出的退火温度下进行其余的循环。

(2)引物的末端核苷酸

引物的3`末端对于控制错误引发非常关键。另一个问题是防止一对引物内的同源性。应特别注意引物不能互补，尤其是3`末端。引物间的互补将导致不想要的引物双链体的出现，这样获得的PCR产物其实是引物自身的扩增。

这将会在引物双链体产物和天然模板之间产生竞争PCR状态，从而影响扩增成功。当一个反应中加入了多对引物(如多重PCR)时，必须对所有引物进行交叉性配对检验。通常，计算机程序不允许引物对的3`末端同源，这样再结合热启动技术，引物双链体的形成机会将大大降低。

(3) GC的合理含量和Tm值

PCR引物应该保持合理的GC含量。含有50%的G+C的20个碱基的寡核苷酸链的Tm值大概在56～62℃范围内，这可为有效退火提供足够热度。一对引物的GC含量和Tm值应该协调。协调性差的引物对的效率和特异性都较差，因为较低的Tm值导致特异性的丧失。

这种情况下引物Tm值越高，其错误引发的机率也越大。若采用太高的退火温度，Tm值低的引物对可能完全不发挥作用。从一批在特定序列范围内已合成好的寡核苷酸中选择一对新的引物时，这种GC含量和Tm值的协调就更加重要了。

(4)、使用引物设计软件

所谓引物选择参数只是一个总体的概念，并非在所有的引物选择程序中一概如此。因此，即使基本参数设置相同，使用稍微有些不同的选择规则的两个程序也很少会选择到同一个引物。例如，计算引物－模板退火温度可以使用几种方法中的一种。Suggs等(1981)的最原始的公式，Tm=2℃×(A+T)+4℃×(G+C)，由于它的简便和能较精确的预计寡核苷酸链的Tm值而颇受欢迎。最近，Rychlik等人(1990)根据最近邻位热动力参数实施的Tm值精确性稍高一些。Wu等人(1991)也根据引物长度和GC含量得到了计算寡核苷酸链最佳退火温度的经验公式。这样，若将预期的引物退火温度定为60℃，就会从相同的靶序列处得到不同的引物。可见像引物Tm值的计算这样基本的东西也会在不同的程序中有所不同。使用计算机软件时，应记住选择参数设置的越广泛，计算机需要考虑的情况越多，将极显著地影响到寻找引物需要的时间。这就是实验设计明确限定用来寻找引物的参数应尽可能狭窄和独特的理由之一。限定更严的寻找参数可以导致更快的寻找速度和得到更高质量的引物。在那些承担更为困难的选择任务（例如选择在许多物种中高度保守的引物或者由蛋白序列选择简并引物）的程序中，引物选择的基本标准经常需放宽以找到适合更高要求的引物。

概括地说， 引物应符合下列条件：引物长度为15-30bp, 过长过短会降低特异性：

（1）、碱基随机分布,G+C%含量宜在45-55%左右。

（2）、引物内部不应形成二级结构,两引物之间不能互补。

（3）、引物3`端碱基最好选T,C,G而不选A,这样有利于延伸。

（4）、为了便于后续的克隆可以在5`端加保护碱基和酶切位点。

得到一套好的引物后, 下一步任务是制备好的核酸模板。

2、TaqE

DNA的体外扩增是由许多不同来源的DNA聚合酶完成的。Saiki等（1985）描述过的最早PCR过程是用E.coli DNA聚合酶I的Klenow片段来完成的.由于这种酶热稳定性差,所以每一轮循环在变性和退火后需加入新酶。后来在PCR中引入耐热性的TaqE （Saiki et al. 1988）避免了这种烦琐的操作，使热循环部分的自动化成为可能。TaqE 没有3`-5`外切酶校正功能,所以错误掺入率为2×10-4,而且在3`端引入非模板互补核苷酸A,从而克隆时需用T-vector。rpfu DNA聚合酶亦称重组Pfu DNA 聚合酶，是将高温噬热菌Pyrococcus furiosis DNA 聚合酶基因克隆，再转化到大肠杆菌中表达，然后经分离精制而成的高保真耐高温DNA聚合酶。由于其具有独特的5`-3`外切酶活性，与传统的高温DNA聚合酶如Taq DNA聚合酶，Tth DNA聚合酶等相比，Pfu DNA聚合酶具有超强纠错功能。目前国际上已发现的具有校正功能的高温DNA聚合酶有 Vent，Deep Vent ，Tli，Pwo，Pfu，UTTma等，但在扩增DNA时，Pfu DNA聚合酶是所有高温DNA聚合酶在扩增DNA时错误率最低的（1×10-6），它比Taq及其突变体低10倍，比Vent和Pwo低2-4倍。

3、反应缓冲液

主要成分为10-50mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，其中Mg 2+ 浓度因能影响引物退火的程度，模板及PCR产物的解链温度，产物的特异性，引物二聚体的形成，酶的活性及精确性而显得极为重要。

4、模板

可以是基因组DNA,质粒DNA,cDNA,RNA等。