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血浆清蛋白的分离纯化与鉴定

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实验原理

不同的蛋白质的分子量、溶解度、以及在一定条件下带电的情况有所不同,可以更据这些性质的差别,分离及提纯各种蛋白质。利用硫酸铵分段盐析法将血清中的清蛋白及球蛋白分离,清蛋白液再利用葡聚糖凝胶过滤法除盐,即可得到较纯的清蛋白。纯化后的清蛋白可利用醋酸纤维薄膜电泳法鉴定其纯度。

盐析:是指将中性盐(如硫酸铵)加入蛋白质溶液中,中和Pr蛋白质表面电荷及破坏水化膜,使蛋白质相互聚集在析出。分段盐析:各种蛋白质盐析时所需的盐浓度和PH不同,利用不同盐浓度下Pr溶解度不同,将蛋白质分段沉淀下来。半饱和硫酸铵沉淀血清中球蛋白(清蛋白溶解)将血清清蛋白和球蛋白初步分离。

常用的除盐方法:半透膜透析;凝胶过滤(层析)。在葡聚糖凝胶层析柱中,由于蛋白质和盐的分子量不同,洗脱速度也不同,大分子蛋白质不能进入凝胶的网孔内而先流出,小分子盐则可进入网孔滞留在凝胶内,收集蛋白洗脱液,即可得到脱盐的蛋白质。用三氯醋酸液鉴定洗脱的蛋白液,以BaCL2 检测硫酸铵。

纯化后的清蛋白用醋酸纤维薄膜电泳鉴定蛋白质分离效果。

实验试剂

1.饱和硫酸溶液:称固体硫酸铵85g于100ml蒸馏水中,在70~80℃水浴中搅拌溶解,用浓氨水调PH为7.2,室温放置过夜,瓶底析出白色结晶,上
层液即为饱和硫酸铵液。

2.生理盐水:称取分析纯NaCl 0.89克,蒸馏水稀释至1000ml.

3.葡聚糖凝胶Sephadex G-25: 称取10克Sephadex G-25,加入200ml 0.02mol/lPH6.5磷酸盐缓冲液溶胀24小时。

4.10%三氯醋酸。

5.1%氯化钡溶液

6.pH8.6,离子强度0.06巴比妥电极缓冲液:称取巴比妥钠12.76g,巴比妥1.66g,蒸馏水加热溶解后再加水至1000ml。

7.氨基黑10B染色液:称取氨基黑10B 0.5g,用甲醇50ml,冰醋酸10ml,蒸馏水40ml溶解。

8.漂洗液:95%乙醇45ml,加冰醋酸5ml及蒸馏水50ml。

实验设备

1.电泳仪、电泳槽

2.电动离心机、层析柱

3.镊子、培养皿、X光软片、滤纸

4.离心管、烧杯、量筒、滴管、小试管、吸管

实验步骤

1.盐析沉淀血清球蛋白

取离心管1支,加入盐析用蛋白质溶液3ml(血浆1ml和生理盐水2ml),再逐滴加入pH7.2饱和硫酸铵液3.0ml,充分摇匀。静置20分钟后离心(3000rpm×10分),取上清液(此液中主要含清蛋白)备用。

2.凝胶层析脱盐

(1)装柱:取层析柱(1×20cm),关紧下端出口,加蒸馏水少许,缓慢加已膨胀的葡聚糖凝胶G-25悬液,至凝胶沉淀10~15cm高,注意凝胶床表面应平整。

(2)上样与洗脱:小心控制凝胶柱下端活塞,使柱上的缓冲液面刚好下降到凝胶床表面,关紧下端出口。取1ml上清液(清蛋白液),小心缓慢地加到凝胶床表面上,注意不要破坏凝胶床表面的平整。打开下端出口,使样品进入凝胶床,小心加入少许蒸馏水于柱内,以洗净柱内壁上的样品溶液,然后可加入多量的蒸馏水进行洗脱。流速为20滴/分。

(3)收集:事先应准备好15支小试管,于加样后开始立即收集洗脱液。每收集约1ml换一管。 检查:按洗脱液的管号顺序每管取出一半,各加10%三氯醋酸5滴,出现白色混浊或沉淀者即有蛋白质存在;取对应沉淀最多的收集管溶液用着电泳鉴定。

(4) 继续用蒸馏水洗柱,流出液用1%BaCl液检测,直至无白色沉淀出现后,洗柱完毕,关闭出口。

3.醋酸纤维薄膜电泳鉴定蛋白质分离效果

(1)取2×8cm大小的醋酸纤维薄膜2张,于巴比妥缓冲液中充分浸湿。将浸湿的膜条取出后用滤纸吸去多余的水分,于无光泽面点样。

(2)在距离膜条一端约1.5cm处,用X光软片蘸取全血清和纯化的清蛋白样品液分别点于两张膜条上。

(3)将巴比妥电极缓冲液加于电泳槽内,再将点样后的膜条放置于电泳槽架上,槽架上用四层滤纸作桥垫。放置时膜条的无光泽面应向下,点样端置于阴极,膜条与滤纸面贴紧。

(4)接通电源,以150V恒压电泳约45分钟。

(5)通电完毕后,用镊子将膜条取出,浸于盛有氨基黑10B的染色液中染色液中,染色5~10分钟取出,立即浸入盛有漂洗液的培养皿中,反复漂洗数次,直至背景漂净为止。用滤纸吸干膜条,观察电泳图谱中蛋白质区带,并与全血清蛋白质的电泳图谱作比较。

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