制备单克隆抗体免疫动物的选择和免疫方案
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制备单克隆抗体免疫动物的选择和免疫方案
1、根据选用的骨髓瘤细胞来源选择免疫用鼠系。常用的瘤细胞来自BALB/c小鼠，因此选用6～10周龄，健康、发育良好的雄性BALB/c小鼠进行免疫。
2、免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb极为重要。一般根据抗原性质，免疫原性和小鼠的免疫反应性决定注射途径，免疫次数，间隔时间和持续时间。
【免疫方案】
（1）颗粒性抗原：颗粒性抗原免疫原性强，如肿瘤细胞、淋巴细胞、细菌等可作为抗原，不加佐剂直接进行免疫，就可获得较好的免疫效果。以细胞性抗原为例，第一次腹腔或尾静脉注射1×106 ～1×107 细胞/鼠，间隔2～3周重复注射1～2次，融合前3 d用同样剂量腹腔或静脉注射加强免疫一次。
（2）可溶性抗原：因其免疫原性较弱，一般要加佐剂，如系半抗原，应先制备成人工免疫原，再加佐剂。目前用于可溶性抗原的免疫方案不断有所更新，如将可溶性抗原颗粒化或固相化，可增强抗原的免疫原性和降低使用剂量；使用细胞因子作为佐剂可以提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原的免疫反应性。
蛋白质、荚膜多糖、病毒、立克次体以及与蛋白质结合的半抗原等均可采用可溶性抗原的方法免疫。取5～100μg抗原与等量完全福氏佐剂(CFA)充分乳化后腹腔或皮下多点注射。以后每间隔2周以同样剂量抗原加等量不完全福氏佐剂腹腔或皮下注射，共3～5次。
一般在融合前3d腹腔或静脉注射无佐剂抗原5～100μg加强免疫，此次注射要缓慢，以防止动物发生过敏性休克而死亡。
（3） 脾内直接免疫：小鼠麻醉后，打开腹腔，沿脾脏长轴方向缓慢注入20～40μg可溶性抗原(可交联于载体上，以增强其免疫原性)或2.5～5×105 细胞，免疫后3～4 d即可取脾细胞进行融合。
（4）体外免疫法： 体外免疫是指在一定条件下，在体外将正常动物或人的脾细胞（或淋巴结细胞、外周血淋巴细胞）与抗原共同培养，然后再与骨髓瘤细胞进行融合。
具体步骤是取未经致敏小鼠脾细胞，加入含微量抗原、50％条件培养液及50μmol/L 2-巯基乙醇的营养液体外培养致敏。如系可溶性抗原取1～50μg/ml，细胞抗原105 ～106 个细胞/1ml脾细胞悬液，细胞性抗原需经60Co照射或用固定剂短暂固定。
（5）体内和体外联合免疫法：体内免疫可采用脾内法，腹腔或皮下多点注射2～3次。融合前加强免疫改为体外诱导法。
即常规方法取免疫过的小鼠脾脏，制备脾细胞悬液，用完全培养液悬浮细胞，加入rHuIL-2、rHuIL-6、PWM和特异性免疫原，使其终浓度分别为50U/ml、500U/ml、1：200和500mg/ml，置5％CO2 37℃温箱中培养5 天后，收获细胞供融合用。
