定量PCR的新技术

real-timeimmuno-PCR

1992年，Sano等人将免疫测定技术与PCR结合，创建了一种全新的极其敏感的抗原分子检测技术，即免疫-PCR（Immuno-PCR），随着这种技术的不断发展，2000年，Sim等使用荧光定量PCR代替普通PCR，发展了免疫定量PCR技术（real-timeimmuno-PCR）。

该技术把抗原抗体反应的高特异性和聚合酶链反应的高敏感性有机结合起来，其本质是一种以PCR扩增一段DNA报告分子代替酶反应来放大抗原抗体结合率的一种改良型ELISA。

1、real-timeimmuno-PCR的基本原理

real-timeimmuno-PCR主要由两个部分组成。第一部分是类似于普通酶联免疫吸附实验（ELISA）的抗原抗体反应。第二部分即荧光定量PCR。

real-timeimmuno-PCR与ELISA的区别就在于ELISA是以碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶来标记抗体，用颜色反应来表明阳性或阴性结果，而前者是以一段特定的双链或单链DNA来标记抗体，用PCR扩增抗体所连接的DNA，因此可由PCR产物的量来反映抗原分子的量。

由于荧光定量PCR的高灵敏度，只要存在着极微量的抗原抗体反应，都能被检测到。real-timeimmuno-PCR的关键之处就在于用一个连接分子将一段特定的DNA连接到抗体上，在抗原和DNA之间建立相对应关系，从而将对蛋白质的定量检测转变为对核酸的定量检测。

2、real-timeimmuno-PCR体系的组成

免疫PCR体系由待检抗原，特异性抗体，连接分子，DNA和PCR扩增系统组成。

（1）待检抗原被检测的样品可以是抗原，或者是作为抗原的某种抗体。待检的抗原可以直接吸附于固相，这一过程与ELISA试验是相同的，因此有些吸附性差的抗原不能应用目前介绍的免疫PCR方法进行检测，需要对免疫PCR进行改进，以便能够检测吸附性差的抗原。

免疫PCR的后续过程需PCR扩增，目前有些方法应用的固相板或管是专门用于免疫PCR，并且有些PCR仅可以直接用微量板进行扩增，这样可以简化实验过程和提高检测的精确性。免疫PCR具有非常高的敏感性，特别适用于检测微量抗原。

（2）特异抗体免疫PCR中的特异性是对应于待测抗原，与ELISA一样，抗体的特异性和亲和力将影响免疫PCR的特异性和敏感性。一般均选用单抗体，这个抗体常采用生物素标记，通过亲和素再结合DNA。

（3）连接分子连接分子是连接特异抗体与DNA之间的分子。Sano等用链亲和素/蛋白A(striptavidin-proteinA)基因工程融合体作为连接分子来连接生物素标记的DNA与抗体，此种融合蛋白的链亲和素部分可识别DNA上的生物素，蛋白部分可识别抗体的Fc段。

（4）DNA和PCR系统免疫PCR中的DNA是一指示分子，用DNA聚合酶将结合于固相上的DNA特异放大，由此定量检测抗原。免疫PCR的敏感性高于ELISA主要是借助了PCR强大的扩增能力。

免疫PCR中的DNA分子可以选择任何DNA，但要保证DNA的纯度，且有较好的均质性，尽可能不选用受检样品中可能存在的DNA。一般可选用质粒DNA或PCR产物等。

DNA的生物素化是用生物素标记的dATP或dUTP通过聚合酶标记在DNA分子上，一般是1个分子DNA标记2个生物素，标记率可达百分之百。免疫PCR的PCR扩增系统与一般PCR一样，主要包括引物、缓冲液和耐热DNA聚合酶。

一种新的高灵敏度的葡萄球菌肠毒素A(SEA)的检测方法――定量免疫PCR

摘要：葡萄球菌肠毒素是细菌超抗原蛋白家族中的一种多肽，除了天然的超抗原性外，它还是肠胃毒素蛋白，严重危害人的健康。由于现在常用的免疫学检测方法在灵敏度和特异性方面不高，因此需要建立一种新的高灵敏度方法用于检测葡萄球菌肠毒素（SE）抗原。

为了提高SE检测的灵敏度，我们建立了全新的极其敏感的免疫定量PCR方法，该技术结合了特异性强的酶联免疫反应（ELISA）和灵敏度高的荧光定量PCR。包被SEA的ELISA板被生物素标记的抗SEA抗体特异性识别，这种信号随着通过对结合在抗体上的DNA进行定量PCR而加强放大。在优化的实验条件下，免疫定量PCR最低能检测出30pg的SEA，是ELISA的100倍。

对于感染了含有致热毒素超抗原的葡萄球菌的宿主，免疫定量PCR能检测出这种宿主中的极其微量的外毒素的含量。

结果和讨论

免疫PCR因其高灵敏度而能够检测微量蛋白，但也往往由于非特异性抗体影响而导致假阳性结果，即使用过量的BSA或牛奶封闭液、减少PCR循环次数，假阳性仍然严重。但是实验发现，使用LowCross缓冲液在不减少检测灵敏度的情况下能有效的降低非特异性反应。

第一种免疫PCR使用常规PCR反应，通过EB染色和琼脂糖凝胶电泳最低能检测300pg的SEA。

高分辨率熔解曲线（HRM）进行SNP基因分型

随着定量PCR仪设计上的不断改进，对温度控制的精密性越来越高，出现了像Rotor-Gene这样的管间温度均一性达±0.01℃的定量PCR仪，而该公司新近推出的Rotor-Gene6000更可达到±0.02℃的温度分辨率。温度上的高分辨率使得运用定量PCR仪进行高分辨率熔解曲线（HRM）分析基因型成为可能。高分辨率熔解曲线根据序列长度、GC含量和互补性分析样品。不同的核酸序列，哪怕仅有一个碱基的差异，也会体现在熔解温度的差别上。基因分型单核苷酸多态性（SNP）是最典型的应用，相比其它方法节约了探针和标记的费用，仅需监测模板熔解温度的不同即可对不同的样品进行分型。当然，要达到如此高的分辨率，定量PCR仪必需具备高强度的光源、高速的数据采集、精确的温度控制和极佳的温度分辨能力。除此之外，第二代的dsDNA内掺式染料，如LCGreen。