RNA的电泳,转膜和杂交
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实验原理:
基本同Southern Blotting,但因RNA是单链分子,必须消除局部区域形成的二级结构,在电场中泳动的距离才能反映它本身的大小,因而需使用变性胶进行电泳;操作过程中应特别注意防止RNA的降解。
实验材料:
经检测质量好的RNA样品。
实验步骤:
1.制胶:
Agarose 1%-1.2%,1×MOPS buffer。
用灭菌的DEPC水定容,加热融化,冷却至70℃加甲醛,使终浓度为2%,通风橱中放1hr。
2.准备电泳液:1×MOPS buffer(小号槽约配500ml,中号槽约配900ml)。
3.制样:测好浓度后按以下体系加样
15 mg RNA + 灭菌的DEPC水 10 ml
Sample buffer 8 ml
loading buffer 2 ml
EB (10mg/ml,专用于RNA) 0.03 ml
65℃水浴变性10 min,立即放冰上,直至点样。
4.点样:点样要仔细,不要漏出,并记录点样顺序。
5.电泳:中号槽,电压100V电泳1hr左右,至溴酚兰离点样孔约3.5-4cm(凝胶在紫外灯下可看到28S和18S刚好分开即可)。
6.转膜:转膜液用500ml 4×SSC加27ml 。
37%甲醛(终浓度为2%);转膜步骤同Southern。注意加溶液后一切操作均在通风橱内进行,以避免甲醛对人体的伤害。
7.照相:将胶及膜取下,分别在凝胶成像系统下看胶上RNA是否有残留,膜上RNA效果是否完好。
8.风干:在超净工作台上吹干。
9.固定:于紫外交联仪内以1200 ENERGY照一次约半分钟,再重复一次,再在超净工作台上吹干。
10.杂交:在杂交管内加约50ml杂交液,将膜卷起放入,注意RNA面朝内,于64℃预杂交1-4hr 。