RNA的电泳，转膜和杂交

实验原理：

基本同Southern Blotting，但因RNA是单链分子，必须消除局部区域形成的二级结构，在电场中泳动的距离才能反映它本身的大小，因而需使用变性胶进行电泳；操作过程中应特别注意防止RNA的降解。

实验材料：

经检测质量好的RNA样品。

实验步骤：

1.制胶：
　　Agarose 1%-1.2%，1×MOPS buffer。
　　用灭菌的DEPC水定容，加热融化，冷却至70℃加甲醛，使终浓度为2%，通风橱中放1hr。

2.准备电泳液：1×MOPS buffer（小号槽约配500ml，中号槽约配900ml）。

3.制样：测好浓度后按以下体系加样
　　15 mg RNA + 灭菌的DEPC水　　10 ml
　　Sample buffer　　　　　　　　　8 ml
　　loading buffer　　　　　　　　　2 ml
　　EB （10mg/ml，专用于RNA）　 0.03 ml
　　65℃水浴变性10 min，立即放冰上，直至点样。

4.点样：点样要仔细，不要漏出，并记录点样顺序。

5.电泳：中号槽，电压100V电泳1hr左右，至溴酚兰离点样孔约3.5-4cm（凝胶在紫外灯下可看到28S和18S刚好分开即可）。

6.转膜：转膜液用500ml 4×SSC加27ml 。
　　37%甲醛（终浓度为2%）；转膜步骤同Southern。注意加溶液后一切操作均在通风橱内进行，以避免甲醛对人体的伤害。

7.照相：将胶及膜取下，分别在凝胶成像系统下看胶上RNA是否有残留，膜上RNA效果是否完好。

8.风干：在超净工作台上吹干。

9.固定：于紫外交联仪内以1200 ENERGY照一次约半分钟，再重复一次，再在超净工作台上吹干。

10.杂交：在杂交管内加约50ml杂交液，将膜卷起放入，注意RNA面朝内，于64℃预杂交1-4hr 。

11.探针准备：预先挖胶回收的PCR产物或酶切产物（better），测浓度，跑胶验证后，按以下体系加入。
　　DNA　　　　　　　　　3 ml（约200ng）
　　ddH₂O　　　　　　　　10 ml
　　DNTP（1.67mM）　　　4 ml
　　杂交Buffer　　　　　　10 ml 
　　Klenow Fragment　　　2 ml
　　α-dCTundefined　　　　　　　5 ml
　　先加入DNA 和 ddH₂O，100℃变性10min，冰上放5min，再加入DNTP和杂交primer，加酶时注意低温操作，先加在管壁上，立即到同位素室加同位素，混匀离心，于室温下反应半小时。

12.探针纯化：在原反应体系中继续加入
　　ddH₂O　　　66 ml
　　NaAc　　　　10 ml
　　无水乙醇　　250 ml
　　混匀离心12000rpm  5min，倒去上清后加500 ml无水乙醇洗，离心2 min，12000rpm，倒去上清，检测信号，达103-104较好，加40 ml ddH₂O和400 ml杂交液之后混匀离心，于100℃变性10min，冰上放置5min。

13.探针：取出杂交管倒去杂交液，加入15ml杂交液，将探针加入,盖紧，于64℃杂交过夜。

14.洗膜，压片：将杂交管中液体倒出，先加少量洗膜液Ⅰ，冷洗5min，倒出，再多加些洗膜液Ⅰ，冷洗10min，将膜取出测信号，根据信号大小决定是否热洗，若信号高，用洗膜液Ⅱ，Ⅲ继续洗，直到信号值达到适宜值为止，即膜上某一区域信号强，而其他区域信号弱代表杂交上了，然后包膜压片，放于-20℃或-80℃3天左右即可洗X片。

15.结果观察与分析。