正交法测定几种因素对酶活力的影响

一、实验目的

1．初步掌握正交法(正交试验设计法)的使用。

2．运用正交法测定底物浓度、酶浓度、温度和pH 值这四种因素对酶活力的影响。

二、实验原理

酶的催化作用是在一定条件下进行的，它受多种因素的影响，如酶浓度、底物浓度、温度、抑制剂和激活剂等都能影响酶催化的反应速度。通常在其他因素恒定的条件下，通过某一因素在一系列变化条件下的酶活力测定求得该因素的影响，这是单因素的试验方法。

对于多因素的试验可以通过正交试验设计法(简称正交法)来完成。正交法是借助于正交表，简化表格计算，正确分析结果．找到实验的最佳条件、分清因素的主次，这样就可以通过比较少的实验次数达到好的实验效果。

本实验运用正交法测定底物浓度、酶浓度、温度、pH 值这四个因素对酶活性的影响，并求得在什么样的底物浓度、酶浓度、温度和pH 值时酶的活力最大。

三、 仪器 、原料和试剂

仪器

试管及试管架、恒温水浴箱、小漏斗及滤纸、分光光度计、吸量管、小漏斗及滤纸、 pH 计。

原料

牛血清白蛋白、牛胰蛋白药。

试剂

1. 牛血清白蛋白：20mL 蒸馏水中加入牛血清白蛋白2.2g，尿素36g，1mol/LNaOH 溶液8mL，室温放置1h，使蛋白质变性。如有不溶物，可过滤除去。再加0.2 mol/LNaH 2 PO 4 溶液至110mL 及尿素4g，调节溶液pH 达7.6左右。

2. 蛋白酶液：3mg 牛胰蛋白酶冷冻干粉，溶于10mL 蒸馏水。

3. 15％三氯乙酸溶液：15g 三氯乙酸溶于蒸馏水．并稀释至100mL。

4. lmol/LpH 7、8、9巴比妥缓冲液

5. Fo1in-酚甲 试剂

① 4％碳酸钠溶液； ②0．2％氢氧化钠溶液；
③1％硫酸铜溶液； ④2％酒石酸钾钠溶液

临用前将①与②等体积配制碳酸钠氢氧化钠溶液。②与④等体积配制成硫酸铜—酒石酸钾钠溶液。然后把这两种试剂按50：1的比例混匀。即成Folin—酚甲试剂。此试剂临用而配制，一天内有效。

6. Folin—酚乙试剂

向2L 容积的磨口回流瓶中加入100g 钨酸纳(NaWO 4 ·2H 2 O)，25g 钼酸钠(NaMoO 4 H 2 O)及700mL蒸馏水，再加人85％磷酸50mL 及浓盐酸100mL，充分混和后，接上回流冷凝管，以小火回流10h(烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防止溶液沸溢)。

回流结束后再加入150g 硫酸锂(Li 2 SO 4 )，50mL 蒸馏水及液溴数滴，然后开口继续沸腾15min，以驱除过量的溴，冷却后溶液呈鲜黄色(如仍呈绿色，须再重复滴加溴水的步骤)，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，过滤，即成Folin—酚乙试剂，滤掖置于棕色试剂瓶中，可在冰箱内长期保存。

若此储存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸数分钟，恢复原色仍能继续使用。

Folin—酚乙试剂储存液在使用前使酸度最终为1moL／L。可用标准NaOH 溶液(1mol/L 左右)，以酚酞作指示剂，当溶液颜色由红一紫色一紫－灰墨绿时即为滴定终点。该试剂储存液的酸度应为2moL/L 右，将之稀释至相当于1moL/L，酸度便可使用。

7. 0.1mol/LNaH 2 PO 4 溶液

8. 尿素

9. 1mol/LNaOH 溶液

四、操作步骤

(一)实验设计

1.确定试验因素和水平

本实验取四个因素，即底物浓度[S]、酶浓度[E]、温度、pH 值。每个因素选三个水平(水平即在因素的允许变化范围内，要进行试验的”点”)。试验因素和选用水平如下表所示。