以毛细管转移进行Northern Blotting转印实验方法与步骤
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要进行北方杂合反应前,必须先将RNA自洋菜胶体转移至硝化纤维纸(nitrocellulose membrane) 或尼龙膜 (nylon membrane) 上,这一个过程称为转印 (blotting)。 一般常用的方法包括毛细管转移法 (capillary transfer)、真空转移法 (vacuum transfer) 与电转印法 (electroblotting)。
毛细管转移法借助吸水纸吸收转移缓冲液时所产生的牵引力量将RNA自洋菜胶体转移至膜上;要转印完全,起码需要作用6 h以上。 虽然所需花费的时间比较长,以其不须要特别的仪器设备 ,毛细管转移法目前仍被普遍采用。
若分析RNA时采用变性聚丙烯酰胺胶体电泳,则必须以电转印法进行RNA转印。至于膜的选择,硝基纤维素膜的优点是比较不会产生非专一性反应;不过其一旦被润湿再烘干的后,容易碎裂,不适用于进行多次杂合反应。
尼龙膜的优点是韧性好,与核酸结合的能力也相当强,正可以弥补硝基纤维素膜的缺点,现已成为主流。 一旦将RNA转移至膜上后,即可以利用紫外线照射法 (uv irradiation) 或真空干燥法 (在真空下80℃加热2 h) 将其固定于转印膜上。
仪器用具:塑料盒;玻璃板;裁纸刀
药品试剂:20×SSC (3 M NaCl, 300 mM sodium citrate);尼龙膜;3MM 滤纸;吸水纸;dH2O/DEPC
方法步骤:
1) 将甲醛洋菜胶体移放在塑料盒内,以dH2O/DEPC冲洗数次,以便去除甲醛。
注意:在移动胶体时请特别留心,不要把胶体弄破了!
2) 注入100 mL 20×SSC,静置5 min。
3) 根据图所示,依序在塑料盒上堆栈玻璃板、滤纸 (作为盐桥)、电泳胶、尼龙膜、三层滤纸、与吸水纸,以便以毛细管转移方式将RNA 转印于尼龙膜上;塑料盒内装入适量20×SSC,以便作为转移缓冲液。
<center> <img alt="以毛细管转移进行Northern Blotting转印实验方法与步骤" height="213" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/09/06/A1378379005.gif" width="323" /></center>以毛细管转移法进行核酸转印
注意:
a. 滤纸与尼龙膜应先以20×SSC 润湿,再用于堆栈。
b. 在滤纸、尼龙膜、与电泳胶夹层间可能会有气泡存在,因此在放好电泳胶、尼龙膜或滤纸后,应立即检视,并以食指轻轻平移的方式小心赶走气泡。
c. 此转印步骤将持续至隔天才结束