聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片段

一、实验目的

1．学习PCR基因扩增的基本原理和操作方法。

2．理解PCR基因扩增在分子生物实验技术中的重要性。

3．了解引物设计的一般要求。

二、实验原理

多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR )：原理类似于DNA的变性和复制过程，即在高温（93-95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～65℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；

在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。

如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。

PCR 反应系统的组成:引物、寡核苷酸、Taq DNA聚合酶、模板DNA、缓冲液。

三、试剂与器材

1、试剂10×EX Taq Buffer (Mg2+ plus)

dNTP Mixture (各2.5 mM)

TaKaRa EX Taq聚合酶5U/μl

模板DNA (已预先稀释)

上、下游引物混合物（已预先稀释）

2、器材 微量移液器及吸头，硅烷化的PCR小管，PCR扩增仪(PTC－100)，台式高速冷冻离心机。

四、操作方法

1．编辑设定PCR扩增程序。

2．PCR管中加入灭菌水、缓冲液、四种dNTP、引物、模板、聚合酶。

3．运行程序进行扩增。

4．电泳检测扩增结果。

五、关键步骤与注意事项

1．试剂湿热灭菌，小管分装，防止污染。

2．所用的PCR扩增管、微量移液器的吸头都要灭菌。

3．试剂混合时要在超净工作台中，戴上一次性手套，防止污染；要离心混匀。

4．每次反应都要设置阴性和阳性对照。

5．根据引物的融解温度设定退火温度，防止出现非特异性扩增产物。