新型光机结合的二维共焦生物芯片扫描仪设计
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引言
生物芯片是指在硅片、玻璃、凝胶或尼龙膜上，通过机器人自动打印或光引导化学合成技术，制作的生物分子微阵列探针，然后与标记的样品分子进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布对靶分子的序列和数量进行分析的一项技术，目前广泛应用于生物医学和生命科学研究中，而生物芯片扫描仪是生物芯片能否得到广泛应用的关键仪器。
生物芯片的荧光信号检测方法，根据检测中采用的光电探测器的类型，可分为光电倍增管（PMT）型和CCD型。PMT型扫描仪，由于采用激光共聚焦原理进行荧光检测，在较高分辨力的弱荧光信号检测场合，具有良好优势。
但因以单束固定波长的激光束扫描，为了使激光扫到整个生物芯片，需要激光头，或生物芯片的二维机械运动，扫描效率则比CCD型低。针对这个问题，本文提出了一种新型的以振镜和远心f-θ物镜（线性成像物镜）结合实现X方向扫描，机械式Y方向线性扫描相结合的光机二维扫描技术。
一、共焦生物芯片扫描仪的共焦原理与扫描实现方法
激光共聚焦生物芯片扫描仪采用共聚焦成像原理，使点源、样品及光阑处于彼此对应的共轭位置，原理图如图1所示。
激光器发出的激光经分光镜和物镜后，激发生物芯片上的荧光分子发光，部分球状散射的荧光释放光被物镜采集，并聚焦于物镜和PMT之间的共焦小孔上，由PMT接收，处于芯片样点外的荧光和杂散光则被共焦小孔阻挡，不能进入PMT。
共聚焦的这一个工作特点，可大大减少由于片基和灰尘产生的背景噪声，提高检测的灵敏度。PMT的荧光扫描仪需要移动扫描器或移动物镜和生物芯片，对芯片各点进行扫描，以获得整幅荧光信息。
扫描器移动后要求物镜能采集到荧光释放光束，这样的物镜很复杂且数值孔径不超过0.3，较为简单的并且采集光效率高的办法，是移动物镜或生物芯片，即实现物镜和生物芯片的X-Y方向二维运动。
在国内外的同类扫描仪中，都采用机械式的二维X，Y线性扫描技术实现，即X，Y方向都采用直线驱动器和直线导轨实现往复运动。此类装置，由于驱动系统的频率限制，驱动器的扫描惯性大，使得扫描效率低，分析时间相当长；并且往复行程长，对直线导轨的精度要求相当高。
二、光机结合的二维扫描系统
为同样实现生物芯片的二维扫描，我们的实验装置设计如图2，采用了振镜和大数值孔径的远心f-è物镜相结合实现X方向扫描，Y方向的运动仍采用直线驱动器和直线导轨实现。
系统中，对于f-è物镜，满足x＝2fè（è为振镜的摆动角度，f为物镜焦距）的线性关系，通过振镜的摆动，激光器出射的红绿激光，可在生物芯片的X方向获得均匀的荧光采样。采用这种二维扫描技术与传统的二维机械扫描相比存在着很大的不同特点和优点，表现在：
1．图中棱镜固定于光路结构中，不随X向驱动平台的移动而移动，克服因棱镜的X向左右移动影响激光聚焦光斑的变换；而在传统的机械二维扫描中，棱镜固定在移动平台上，扫描过程中受震动，焦深产生变化，影响芯片表面上的聚焦光斑，最终会影响仪器分辨力。
2．X方向的直线往复运动采用振镜的摆动获得，可实现高速扫描，实验中选用的振镜摆动频率可高达100Hz，则在用80Hz的高速扫描下可将分析效率比一般的扫描仪提高4倍，极大缩短了共焦扫描仪的耗费时间；机械二维扫描中，X，Y向采用直线电机驱动，因一般的驱动频率仅为20Hz左右，限制了扫描效率。
3．振镜以扭力棒原理构成，具有相当低的零点漂移（μrad级）和扫描误差（μrad级），运转平稳，无震动噪声，变形小，使用寿命长；机械二维扫描中，X，Y向直线电机驱动因负载大（扫描头固定在移动平台上），则惯性大，运转不平稳，噪声大，后期维护工作繁重，对机械精密度要求高。
另外系统结构特点中，如设计和加工的远心f-è物镜，不可避免存在少量畸变误差，可以通过振镜驱动器的反畸变非线性驱动加以补偿，使得能在均匀的扫描频率下得到真实的图像重建。
三、实验结果和分析
此共焦生物芯片扫描仪实现双波长激光扫描，设计中采用分时复用法则进行，所谓分时复用，即为图2所示的两激光器前的开关和PMT前的滤色片随同一波长切换，分别实现单激光的扫描的方法，Y向直线驱动来回一周期，完成好两波长扫描。
采用此光机结合的二维扫描装置，我们对规格L×W为70mm×22mm的生物芯片进行了扫描分析，得到图像如图3所示（未经图像处理），右侧图为左图生物芯片第一行第四个矩阵块的放大图。
此芯片为丙型肝炎病毒分片段抗体的蛋白芯片，用532nm的绿激光，以分辨力δ为10μm扫描。扫描参数设置振镜摆动频率fo为50Hz（fomax=100Hz），则单光束扫描耗时为ts=L/δfo＝140″，此时采样频率fs=Wfo/δk＝146.7kHz，其中k为振镜摆动周期中与占空比有关的系数，我们实验中占空比为3：1，k即为3/4，表示振镜摆动一个周期中，3/4周期扫描数据被采集成像。则计算可知，本实验扫描仪扫描时间<5min，国外同类仪器的扫描时间在相同分辨力时多为>5min，相比较可以明显提高扫描效率。
判断一个生物芯片扫描仪的性能优劣，还有分辨力和灵敏度等的标准。图4为扫描分辨力板重建的图像（由原始数据重建，未经图像处理，噪声引入使得图像不十分清晰平滑），左边为10µm分辨力的扫描图，从图看出，标记为10的线对清晰可分辨，则表明此实验装置完全达到10µm的结果。右图是5µm分辨力扫描图，标记5的线对模糊不可辨认，实验结果还未理想接近5µm的分辨力。究其原因，除了系统本身设计的理想分辨度外，还与影响共焦系统信息量的因素有关，实验中可通过调整激光光斑大小，选择适当的探测小孔尺寸（在实验中采用了直径为0.2mm的小孔），微调控制小孔的位置，调节探测器即光电倍增管的增益等措施提高检测灵敏度和信噪比，并还可以通过适当的图像处理方法增加信噪比，此等措施都能不同程度提高分辨力，以获得更佳的图像质量。目前分辨力达5µm的实验，仍在进行设计与调整中。
另外实验数据分析中，考虑到在系统设计时，振镜的有效垂直面积是小于物镜的通光孔径，扫描中由于f-è物镜收集的荧光仍从振镜反射返回，振镜摆动会引起有效反射面积变化
，式中wl为振镜面积。我们实验中è的角度为6.5°，产生最大8%的变化，此时采集重建的图像会出现两边弱，中间强的不均匀现象。解决这个问题可通过扫描一个均匀样片得到标定的补偿值，然后对生物芯片扫描的数据进行补偿处理。实验结果与GenePix 4000B的扫描仪得到的图像进行对比发现，几乎无差异，不影响芯片的分析处理。
四、结论
实验表明，设计的光学f-è物镜和振镜相结合代替共焦生物芯片扫描仪的二维扫描中X向扫描技术，以其能保证扫描仪分辨力和灵敏度的情况下，较大幅度提高扫描速度，具有一定的技术创新和技术优势。目前本实验的光机二维扫描技术已申请国家专利。我们设计制作的这种激光共聚焦生物芯片扫描仪不久即将出台，相信在对新世纪我国的生物芯片技术的发展和生命科学相关领域的研究，皆将有良好的促进意义。
