掌握斑马鱼总RNA的提取实验方法
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【实验目的】
1、掌握提取总RNA的原理和技术。
2、学习和掌握控制RNA酶活性的方法。
【实验原理】
分离纯净、完整的RNA对于分子克隆的实验是很重要的，而且是进行基因表达分析的基础。在总RNA中，75-85%为rRNA（主要是28S－26S/23S和18S/16S rRNA），其余的由分子量大小和核甘酸序列各不相同的mRNA和小分子RNA如tRNA、snRNA及snoRNA等组成。
mRNA一般只占总RNA的1％左右，而且由于RNA酶（核糖核酸酶 ，RNase）广泛存在、活性稳定，其反应也不需要辅助因子，因而在RNA的制备过程中只要存在少量的RNA酶就难以获得完整的RNA；
而所制备的RNA的纯度和完整性又直接影响着RNA分析的结果，长度大于4kb的转录本本身存在的几率更小，其对于痕量RNase的降解也比小转录本更敏感，所以RNA的制备与分析操作难度极大，克隆长片段的基因更加是一门艺术。
总之在所有RNA实验中，归根结底就是防止RNA酶的污染，分离到全长的RNA。
在实验中，一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。因为各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶，所以所有分离提取RNA的方案都是在能导致RNA酶变性或失活的化学环境中使RNA释放出来。另一方面要严格控制外源性RNA酶的污染。
RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。
这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽 、研究人员的手及各种试剂。而为避免RNA酶的污染，实验中所用到的全部溶液、玻璃器皿、塑料制品等都需特别处理。
近年来，常用的RNA酶抑制剂主要有：
（1）异硫氰酸胍。异硫氰酸胍是目前被认为最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。
（2）焦碳酸二乙酯（DEPC）。是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。DEPC通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性，使用浓度为0.05-0.1‰。
（3）钒氧核糖核苷复合物。由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，因而能百分之百地抑制RNA酶的活性。其使用浓度为10 mmol/L。
（4）RNA酶的蛋白质抑制剂（RNasin）。是一种从大鼠肝或人胎盘中分离出来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶紧密结合形成复合物从而使其失活。
（5）其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。本实验采用DEPC对实验中所用到的溶液、玻璃器皿和塑料制品等进行处理。
总RNA制备的方法很多，如：
1）异硫氰酸胍－苯酚法，许多公司有现成的总RNA提取 试剂盒（如Trizol试剂盒，其实质也是异硫氰酸胍－苯酚法），从而可快速有效地提取到高质量的总RNA。
2）超离心方法，可以获得丰富且质量高的RNA。缺点是实验时间比较长，要求离心过夜。
3）其它一些试剂盒，主要是利用某些特定的介质吸附RNA，驱除其它杂质以后，将纯净的RNA洗脱下来，这样就可以在短时间内获得纯净的RNA。但是价格比较昂贵。
目前，最常用的RNA纯化方法是使用异硫氰酸胍／酸性酚的一步法。异硫氰酸胍－苯酚法的基本过程是：先将样品（以动物的腺体或组织为例）放进匀浆器中加入异硫氰酸胍变性液进行匀浆裂解，再用酸性苯酚（水饱和酚）、氯仿抽提除去DNA和变性的蛋白质，最后用异丙醇沉淀出RNA。
Trizol试剂法进一步提高了RNA的提取能力，可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解RNA。该法甚至可以从最少100个细胞或1mg组织中提取RNA。本实验就简单介绍Gibcol公司的产品Trizol Reagent（Total RNA Isolation Reagent）的使用方法。
不同公司的RNA提取 试剂盒具体的使用方法略有不同，可参照产品使用说明书。
此外，不同组织中提取的RNA，其中残留痕量RNase污染的几率也不同，为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。
从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃（用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物）。
来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2M及4倍体积的乙醇，室温放置3-5分钟，10,000×g离心5分钟。
【试剂与器材】
（一）试剂
1、灭菌的DEPC水：量取一定体积的三蒸水，加入0.05-0.1‰的DEPC，磁力搅拌器搅拌过夜或者摇床低速振荡过夜，121℃高压蒸汽灭菌50分钟，冷却后，作为试剂配制用水。
2、变性液 （500mL）
4.0M 异硫氰酸胍236.32g
0.015 M醋酸钠，pH7 1.02g
20mM 巯基乙醇 0.7mL
0.5% Triton X-1002.5mL
0.5% NP 40 2.5mL
0.25% 异戊醇1.25mL
3、水饱和酚
用DEPC处理过的水饱和重蒸酚：取适量重蒸酚，加等体积的DEPC处理水，磁力搅拌器搅拌过夜，经常更换上层的水，直到pH为4.0—5.0之间。上层仍用水覆盖，置于4℃冰箱保存。
4、氯仿：异戊醇（24：1）
5、异丙醇
6、75%乙醇
7、2M NaAc（pH4.0）
（二）器材
1、烧杯（1000，500，100，50mL若干），
2、量筒（1000，500，250，50，20 mL若干），
3、玻璃棒，药勺，试剂瓶，三角瓶。
上列器皿均用锡箔纸密封，然后置180℃干烤5小时。
4、枪头（1000、200、20 μL），枪头盒。
5、离心管 (1.5mL、2mL、7mL离心管)，
上列塑料制品均用含0.05-0.1‰ DEPC的水浸泡过夜。
6、冷冻高速离心机
7、紫外分光光度计
【操作方法】
（一）异硫氰酸胍-苯酚法
1)处理样品：引颈处死小鼠，剖腹切取肝脏组织100mg-150mg，加入1.0ml-1.5ml变性液，置于匀浆器中进行匀浆。
2)将匀浆后的组织样品（含变性液）移至7mL离心管中，加入0.1倍体积的2M NaAc (pH4.0)，加盖并轻轻颠倒混匀。
3)加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），颠倒混匀，用力振荡10秒钟，然后冰上放置15min。
4)4℃，10,000g，离心20min。
5)小心吸取上层水相至一个新的离心管。注意不要吸出中间层（该层富含蛋白质和DNA）。
6)加等体积预冷的异丙醇与样品混匀，置-20℃ 30分钟以沉淀RNA。对于RNA含量很少的样品可沉淀过夜以提高回收率。
7)4℃，10, 000g，离心15分钟沉淀RNA。
8)弃上清，将RNA沉淀重新悬浮于适量变性液中，置于旋转摇床上多角度摇晃至RNA溶解，也可加热到65℃促进溶解（时间尽可能短）。
9)重复步骤2-6。
10)弃上清，加预冷的75%乙醇，洗涤沉淀；4℃，10, 000g，离心15分钟，弃上清。
11)真空或室温干燥使样品中的乙醇挥发殆尽，但不宜过分干燥，否则沉淀难以完全溶解。
12)将RNA溶于20-50 µl无RNA酶的去离子水中。
用紫外分光光度计测定样品在260nm、280nm波长的光密度并初步估计浓度和纯度。 计算浓度：OD260为1时，为40ug RNA，
样本RNA含量（ug/ul）= OD26undefined稀释倍数40~H1000~K~Hp~M~Kp~M~2~1~0~0纯度：纯RNA样品的A260/A280比值为1.8~2.0，
当OD值260/280<1.8时，提示有蛋白或酚的污染，要重新用酚/氯仿抽提
13)电泳检测总RNA的纯度（见下一实验）。
（二）Trizol Reagent 处理法（参照GIBCO BRC公司有Trizol试剂盒）
1)处理样品：引颈处死小鼠，剖腹切取肝脏组织50mg（或106-107个细胞），以1 ml Trizol Reagent处理50－100mg的组织样品（或0.25ml的液体组织样品）的比例加入Trizol液，剪碎，快速匀浆。
2)取1.5 ml 的Trizol Reagent处理的组织样品于2 ml 离心管中，15-30℃，静置样品5分钟（min）使核蛋白解聚。
3)加入0.4 ml氯仿，用手强力振荡15秒，15-30℃静置3－15分钟（min）。
4)2-8℃，低于12,000g（或15000转/分）离心15分钟。
5)将上层水相（约1ml）转移至另一个2 ml 离心管中，加入1 ml异丙醇混匀，15-30℃，静置10分钟。如果RNA量少，可以放置过夜
6)2-8℃，低于12,000g（或15000转/分）离心10分钟。
7)弃去上清，加1ml 75% 乙醇洗沉淀。
8)2-8℃，低于7,500g（或10000转/分）离心5分钟。
9)弃去上清，尽量吸去乙醇。室温干燥5－10分钟（min）左右（不要完全干燥）。
10)加入适量无RNA酶的去离子水溶解RNA，保证充分溶解。
11)分光光度计测定浓度（同上。）
12)琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的纯度（见下一实验）。
RNA溶液可置于-20℃保存备用。对于长期保存，应重新补加NaAc(pH4.0)至0.25M，再加2.5倍体积乙醇，-70℃保存。
【注意事项与提示】
实验要求创造一个无RNA酶污染的环境。主要包括两个方面的工作，其一，尽力抑制组织细胞中内源性RNA酶的活力，并尽可能地去除；其二，极力避免来源于操作者的手及实验的器皿和试剂等外源性RNA酶的污染。由于RNA酶到处存在，不易失活，极易造成污染而导致RNA的降解，造成实验失败。
因此建议所有用品均应严格按要求消毒，注明RNA专用。严格按无菌操作要求操作。
（一） 防止各种试剂、设备中RNA酶污染的措施
1.所有的玻璃器皿均应在泡酸反复冲洗后，于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
2.塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。
3.有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再在室温下用3% H2O2浸泡10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。
4.配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
5.设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。
（二）操作过程中的防范措施
1.RNA酶最主要的潜在污染源为研究人员的手及唾沫等。因此，凡与RNA的提取有关的一切物品，切记戴手套取之，勿用手直接接触；而且，在实验过程中要勤换手套。
2.实验台、微量取样器和离心机等实验用具应用75%的乙醇擦拭干净。
3.DEPC有致癌之嫌，需小心操作。戴双层一次性手套，一次性口罩以防之。
4.必须保证塑料制品被DEPC水浸透，内部没有气泡，对于枪头和离心管，必要时应用枪逐个用水灌注。
5.用镊子逐个敲去离心管内的DEPC水，装于干烤过的烧杯，用牛皮纸封住杯口，外加锡箔纸密封；尽量敲去枪头内的水，装于处理过的枪头盒，报纸包好。高压蒸汽灭菌50分钟。
6.实验中可用DEPC处理的试剂和容器，加入DEPC至0.1%浓度，然后剧烈振荡10分钟，再高压灭菌以消除残存的DEPC，以免其日后抑制其它酶的活性，导致实验失败（DEPC能和腺嘌呤作用而破坏相关的酶的活性以及mRNA活性）。另外，DEPC能与胺和巯基反应，因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。
7.Trizol Reagent处理的组织样品加入氯仿处理离心后，分成三层：上层为RNA，中层白色为变性的蛋白质，下层为基因组DNA。故移取上清时注意轻缓，不要旋起中间层、以免吸出其中的蛋白质和DNA杂质。
（三）RNA提取各步骤中应把握的细节
1.实验过程中应将组织充分匀浆，一般可先将组织块用剪刀剪碎，以利于快速匀浆。
2.抽提过程中，由于异硫氰酸胍是RNA酶的强抑制剂，在整个实验过程中不会产生RNA的降解。但在加入75%乙醇洗涤时，以及RNA干燥和加水溶解时须防止RNA酶的污染。
3.去除内源性RNA酶的方法一般是用酚/氯仿反复抽提，直至中间的蛋白层基本消失。在酚/氯仿抽提过程中，一定要颠倒混匀充分，这样才能使蛋白质充分变性，才能充分去除蛋白质与RNA酶。为了提高RNA的纯度，我们的经验是至少抽提3次以上。
4.在吸取上清时，切不可将上清与酚交界处的蛋白及下面的酚吸起，造成RNA的污染。因此，通常轻轻吸取上清，且留有部分上清，以免搅起紧邻着的酚。
5.若需抽提大量RNA时，以上试剂、试管可按比例放大。所获RNA建议分装，以免使用过程中反复冻融。
6.如果是培养细胞，先收集细胞，用PBS缓冲液反复漂洗3次，再加Trizol溶液混匀细胞，后面的实验过程一致。
【实验安排】
第一天：处理实验所用的玻璃、塑料用品和配DEPC无菌水、水饱和酚；
第二天：高压灭菌所浸泡的塑料用品以及配变性液；处理组织样品，并进行实验至步骤5）：放置过夜；
第三天：完成实验并进行总RNA的质量检测：光吸收法和琼脂糖凝胶电泳法。
【实验报告要求与思考题】
1、计算出所提取的总RNA的A260/A280值以及浓度。
2、写出3种常用的RNA酶的抑制剂及其作用机理。
附：紫外分光光度计的使用方法
1、使用前，打开电源，预热30分钟以上。
2、激发氢灯，至指示灯发亮（电源旁边的按钮）。
3、关上顶盖。将A/T旋钮打到T，调节到100.00。打开盖，调节到0.00。
4、装0.2 ml无菌水于微量比色杯中，重新调零。
5、加样品稀释至0.2ml无菌水，颠倒混匀，置于比色杯中。
将A/T旋钮打到A，测定其OD260
6、将刻度调到280nm，重新调零，读取OD280。
7、计算A260/280。根据公式计算浓度：
A260×稀释倍数×40（单链核酸）（微克/毫升）
A260×稀释倍数×50（双链核酸）（微克/毫升）
鉴定RNA纯度和浓度的方法
1）检测RNA溶液的吸光度
260、320、230、280nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的，我们只看OD260/OD280（Ratio，R）。
当OD260/OD280的比值为1.8-2.0时，我们认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是<2.2的）。通过此时的A260值，即可换算出RNA的浓度。
当R<1.8时，溶液中蛋白或者是其他有机物的污染比较明显，可根据实验需要决定这份RNA的命运。当R>2.2时，说明RNA已经水解成单核苷酸了。
A260/A230的比值还表明RNA的纯度，其值小于2.0表明裂解液中有亚硫氰胍和belta-巰基乙醇残留，其值大于2.4，需用乙酸盐，乙醇沉淀RNA。
2）RNA的电泳图谱
一般的，RNA的电泳都是用变性胶进行的，但是根据近年的经验，如果仅仅为了检测RNA的质量是没有必要进行如此麻烦的实验的，用普通的琼脂糖胶就可以了。电泳的目的是在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值，或者是mRNA smear的完整性。
一般的，如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，则认为RNA的质量是好的（见图1－1）。通过与标准浓度的marker进行比对也可以获知RNA的浓度。
以上是常用的两种鉴定RNA纯度和浓度的方法，但是这两种方法都无法明确的告诉我们RNA溶液中有没有残留的RNA酶。如果溶液中有非常微量的RNA酶，用以上方法很难察觉，但是大部分后续的酶学反应都是在37℃以上并且是长时间进行的。
如果RNA溶液中有非常微量的RNA酶，后续的实验中就会有非常适合的环境和时间发挥它们的作用，而导致实验的失败。下面，介绍一个可以确认RNA溶液中有没有残留RNA酶的方法。
3）保温试验
从RNA溶液中吸取两份约1000 ng的RNA加入0.5 ml的离心管中，用pH7.0的Tris缓冲液补充到10 ul的总体积，然后密闭管盖。把其中一份放入70℃的恒温水浴中,保温1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。
随后，取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别（当然，它们的条带也要符合方法2中的条件），则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染，RNA的质量很好。相反的，如果70℃保温的样本有明显的降解，则说明RNA溶液中有RNA酶污染。
通过了保温实验的检测并且在后续的实验中还是非常小心的防范RNA酶，实验应该是很难失败了！
