丁香实验_LOGO
登录
提问
提问
我要登录
|免费注册
点赞
收藏
wx-share
分享

DNA的提取 掌握这些就够了

丁香园论坛

8049

今天师兄从丁香园论坛里扒拉出来一些干货,对一些细菌、真菌 DNA 提取方法,做了总结,现在分享给大家:

细菌 DNA 的提取:

方法一:

试剂:

1. 抽提缓冲液

2% CTAB (W/V)、2% PVP K25 (w/v)(去色素)、100 mM Tris-HCl (pH8.0)、25 mM EDTA (pH8.0)、2.0M NaCl

2.10M LiCl

3. 2M LiCl

4.DEPC-water(抑制 RNA 酶活性)

5. 3M NaAc (pH5.2)

6. 96% 乙醇

7. 70% 乙醇

步骤:

1. 抽提缓冲液 65℃ 预热;

2. 加菌体到已经预热的缓冲液(700ul)中混匀,65℃,10 min;

3. 加酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),振荡,离心 12,000rpm,10 min;

4. 取上清,加氯仿/异戊醇(24:1)振荡,离心 12,000rpm,10 min;

5. 取上清,重复 4 步骤;

6. 加入 1/10 体积的 3M 醋酸钠和 1.5 倍体积的乙醇(或加入等体积的异丙醇),-20C 沉淀;

11. 离心 12,000rpm,10 min;

12. 弃上清,70% 乙醇洗,也可以再用 100% 乙醇洗,然后溶解于 100 ml 水中。

方法二:

注意:我们常用的方法,但是有时有些细菌特别不好提,就用上面的方法。

1. 将菌株接种于液体 LB 培养基,37℃ 震荡培养过夜。

2. 取 1.5 ml 培养物 12000rpm 离心 2 min。

3. 沉淀物加入 567 ul 的 TE 缓冲液,反复吹打使之重新悬浮,加入 30ul 10%SDS 和 15ul 的蛋白酶 K,混匀,于 37℃ 温育 1 h.

4. 加入 100ul 5mol/L NaCl, 充分混匀,再加入 80ul CTAB/NaCl 溶液,混匀后再 65℃ 温育 10 min。

5. 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀,离心 4-5 min, 将上清转入一只新管中,加入 0.6-0.8 倍体积的异丙醇,轻轻混合直到 DNA 沉淀下来,沉淀可稍加离心。

6. 沉淀用 1 ml 的 70% 乙醇洗涤后,离心弃乙醇.

真菌 DNA 的提取:

方法一:

1. 取真菌菌丝 0.5 g, 在液氮中迅速研磨成粉

2. 加入 4 mL 提取液,快速振荡混匀

3. 加入等体积的 4 mL 的氯仿: 异戊醇 (24:1),涡旋 3~5 min(此处是粗提没有加酚,可以节约成本的哟!)

4.1000rpm,4℃,5 min

5. 上清用体积的氯仿: 异戊醇 (24:1) 再抽提一次(10,000 rpm,4℃ 离心 5 min)

6. 取上清,加入 2/3 倍体积的-20℃ 预冷异丙醇或 2.5 倍体积的无水乙醇沉淀, 混匀, 静置约 30 min

7. 用毛细玻棒挑出絮状沉淀, 用 75% 乙醇反复漂洗数次, 再用无水乙醇漂洗 1 次, 吹干,重悬于 500 mulTE 中

8. 加入 1 ul RNaseA(10 mg/mL),37℃ 处理 1 hr

9. 用酚(pH8.0): 氯仿: 异戊醇 (25:24:1) 和氯仿: 异戊醇 (24:1) 各抽提 1 次(10,000 rpm,4℃ 离心 5 min)

10. 取上清,1/10V 3M NaAc,2.5V 体积的无水乙醇, -70℃ 沉淀 30 min 以上

11. 沉淀用 75% 乙醇漂洗,风干, 溶于 200 ulTE 中,-20 ℃ 保存备用

12. DNA 提取液:0.2M Tris-HCl(pH 7.5),0.5M NaCl,0.01M EDTA,1%SDS,

3M NaAc

方法二:

1. 真菌菌丝 0.5-1 g, 在液氮中迅速研磨成粉

2. 加入 3 mL 65℃ 预热的 DNA 提取缓冲液,快速振荡混匀 65℃ 水浴 30 min, 期间混匀 2-3 次

3.加入 1 mL 5M KAc,冰浴 20 min

4.等体积的氯仿: 异戊醇 (24:1) 抽提 1 次(10,000 rpm,4℃ 离心 5 min)

5.取上清,加入 2/3 倍体积的-20℃ 预冷异丙醇, 混匀, 静置约 30 min

6.用毛细玻棒挑出絮状沉淀, 用 75% 乙醇反复漂洗数次, 再用无水乙醇漂洗 1 次, 吹干,重悬于 500 mL TE 中

7.加入 1 ul RNaseA(10 mg/mL),37℃ 处理 1 hr

8.用酚(pH8.0): 氯仿: 异戊醇 (25:24:1) 和氯仿: 异戊醇 (24:1) 各抽提 1 次(10,000 rpm,4℃ 离心 5 min)

9.取上清,1/10V 3M NaAc,2.5V 体积的无水乙醇, -70℃ 沉淀 30 min 以上

10.沉淀用 75% 乙醇漂洗,风干, 溶于 200 ul TE 中,-20 ℃ 保存备用。

以上就是一些实验室常用的方法.

想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你,都可以成为师兄的好伙伴。

师兄微信号:shixiongcoming

提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
关注公众号
反馈
TOP
打开小程序