【原创】寻找KO的阳性克隆——CruiserTM酶

近年来，ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等基因组编辑技术可谓是层出不穷，尤其是CRISPR/Cas9，一出现便在全球范围内掀起一股热潮。同时，各大公司也开发出一系列相应的产品，其中一种至关重要的就是基因敲除阳性克隆筛选的试剂。

目前，市面上只有Genloci的CruiserTM、Transgenomic的SURVEYOR和NEB的T7EI这三种产品和测序这种方法，被用于基因敲除阳性克隆的筛选。然而，SURVEYOR是进口产品，价格贵，货期长；T7EI可以识别多种DNA结构，如十字形DNA结构、Holliday结构等，故易出现假阳性；测序耗时长（1-3天），常常出现测序无信号等问题。

今年年初，Genloci通过植物基因工程表达产生高纯度的CruiserTM酶，它是一种具天然强活性的核酸内切酶，与CelⅠ同源。该酶能够高效特异地识别异源双链DNA的突变位点，并从突变位点的3’-端高效地切割异源双链DNA，不会出现假阳性。

今年6月，Genloci推出CruiserTM基因敲除检测试剂盒，该试剂盒可广泛应用于精确检测人、哺乳动物、细菌、真菌、病毒以及植物基因的敲除，尤其适用于ZFN技术、TALEN技术和CRISPR/Cas9技术的基因敲除研究。

实验流程

1. 基因组DNA的准备：提取野生型和突变型细胞的基因组DNA。Genloci公司专为阳性克隆筛选设计的TNA抽提试剂盒也能帮您的忙，只需500个左右的细胞即可提取全基因组DNA。

2. 杂交DNA的准备：

a) PCR引物设计：一般扩增产物长度为300~600 bp

<center> <img height="145" src="http://img.dxycdn.com/upload/2014/11/03/19/16926793.jpg" width="1018" /></center>

b) PCR扩增：获得杂交DNA

3. CruiserTM酶筛选阳性克隆：无需纯化DNA，直接使用PCR产物，混合体系后45℃下反应15~20 min

<center><img height="162" src="http://img.dxycdn.com/upload/2014/11/03/21/43097828.jpg" width="562" /></center><center>K562细胞中Atg10基因敲除案例</center>

M：100 bp-DNA Marker；pool：混合克隆；clone1-18：单克隆；positive：Positive Control DNA

结论：pool（混合克隆）的结果显示，基因敲除的效率约为40%。clone3, 7, 8, 11, 15和17为潜在的阳性克隆，后续直接进行TA克隆进行验证等位基因突变情况。
现在，您是否还在为筛选不到阳性克隆而烦恼，有了这一款产品，相信就可以高效精准地找到KO阳性克隆了。