竞争PCR作mRNA定量

此种技术的策略是用一种竞争模板与靶序列cDNA同时扩增，使用同样的引物经过PCR扩增之后，能将这些靶cDNA区别开来。竞争模板是一种突变的靶cDNA，它的突变位点为一个新的限制性内切酶位点，这种突变体能够很容易地用PCR定点诱变来得到。

也有利用基因组质粒DNA作为竞争模板，在紧靠一小段(10～200bp)内含子序列的两个外显子上选择寡核苷酸引物，按照靶cDNA的长短区分扩增竞争模板的方式进行的，但它的扩增效率可能不如cDNA扩增效率高。扩增之前可以精确定量竞争cDNA模板的浓度，再将其作系列稀释与靶cDNA共同扩增。

竞争模板的初始浓度的任何改变，都会影响其最终产物，无论影响PCR定量的哪个因素的改变，对两种模板的影响是相同的，因此二者的扩增产量比率在反应中会保持一致。

cDNA靶序列的竞争模板相对含量可以用溴化乙锭染色，电泳凝胶直接扫描法进行测定，或者采用掺入放射性同位素标记dNTP的方法来测定。因为竞争模板开始时的浓度是已知的，则cDNA靶序列的最初浓度能测定出来。

本法能精确测定1ng总mRNA中1pg的cDNA靶序列，可定量10个细胞内的特异mRNA，亦能用于细胞培养中集落的筛选，或流式分类细胞的特异mRNA定量。

材料

1. 引物选择：扩增靶cDNA序列的一对引物按一般引物设计原则，扩增长度约200 ～600bp。

2. 竞争模板制备，可采用重叠延伸法：两种PCR产物序列一端重叠，均含有由PCR引物引入的同样突变位点，除去未掺入的多余引物后，将两种产物混合变性/复性，出现了两种异双倍体产物，其中一种产物为3末端单链部分，可用Taq酶延伸，产生新的两个包括重叠产物全长的片段，新片段用扩增靶cDNA引物再进行扩增，可得到带突变位点的靶cDNA。

竞争模板cDNA制备后用分光光度计精确定量,然后配制精确的系列稀释溶液，浓度为10ng～1pg/ml。

3. 4种浓度dNTP贮液均为2.5mmol/L，混合之前需测定浓度。

4. Taq酶5U/μl，AMV或mMLV逆转录酶，RNA酶抑制剂。

5. 20mmol/L DTT贮备液。

操作方法

1． 逆转录反应：制备的mRNA纯度愈高，定量的结果愈好，除使用商品化的试剂盒外，对于非常少量的细胞可在裂解液(0.5％NP-40，10mmol/L Tris-HCl（pH8.0），10mmol/L NaCl，3mmol/L MgCl2 )中冰浴5min，离心除去细胞核和残片后，上清即可用于逆转录反应。

反应体系：20μl反应体积，10～100ng总RNA或10个以上细胞裂解液上清，20～50pmol特异反义引物或100pmol六聚寡核苷酸引物，dNTP各500μmol/L，逆转录酶(按厂家推荐用量)，DTT 1mmol/L，RNA酶抑制剂2～5U，DEPC处理的双蒸水补足20μl体积。37℃保温1h。

2． PCR：采用制备标准混合液进行系列浓度稀释，以确保本法的精度。若采用放射性计数确定最终结果时,反应中一般加入α-32 P dCTP 1.85×106-BQ/ml，而不降低dCTP的浓度，PCR定量时，最好先在较大的范围内(稀释液呈10倍递增)粗略确定cDNA的量， 然后再于小范围(100倍)内进行第二次PCR精确定量。

如图所示，以基因组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gGM―CSF)为竞争模板的GM-CSF(cGM)的定量，上、下游引物分别来自于两侧的外显子，中间的内含子为93个碱基对，因此,基因组DNA为模板的产物与cDNA为模板的产物分别为290bp和193bp,很容易区分开来。