[资料] 绿色荧光蛋白GFP特性及应用

绿色荧光蛋白GFP来源及生化特性: GFP 主要来自两种海洋无脊椎动物,西南太平洋水母———Aequorea victoria 和佐治亚沿海水域的三色堇———Renilla renifomis 。

上述来源的GFP ,其原始发光蛋白基团具有将蓝色的化学发光演变为绿色荧光的生物发光特性。Plinythe Elder 于公元1 世纪最早报道了这种生物发光现象。20 世纪60 年代以来,Blinks 等实验室先后研究了GFP 的生物化学特性。野生型GFP (wt2GFP) 的分子量约为27kD ,由238 个氨基酸残基组成。

成熟的GFP 蛋白是高度稳定的,在pH 为11 、65 ℃的条件下仍保持荧光,且数小时内不被蛋白酶降解。GFP 的发光基团是由Ser65 、Tyr66 和Gly673 个氨基酸残基经过环化、脱氢后形成的咪唑环。荧光的发生与环境密切相关,其真正的发光部位为咪唑环上的阴离子酚。

多管水母来源的GFP 有两个吸收峰:395nm 和470nm ,但主峰在395nm ,两种波长的任何一种光激发均可使GFP 产生508nm 的绿色荧光。研究表明,GFP 的发光基团是在翻译后自动催化形成的,并且GFP 在合成后需经一定的折叠形成正确的构象才具有发光功能,其高级结构的维持几乎需要所有的残基参与。

自从Prasher 等于1992 年成功克隆GFP 的cDNA 以来, GFP 在各种异源细胞中的表达、GFP 作为一新型报告分子或定位标记物以及GFP 突变体等的研究日益受到重视。

发光机理:水母和三色堇的GFP 发光虽然均需要Ca2 + 激发,但二者的发光机理略有不同:在水母中, Ca2 + 结合到发光蛋白上使荧光素被氧化而释放出蓝光,而进一步激发GFP 发出绿色荧光。

而三色堇的发光是由荧光素酶氧化荧光结合蛋白结合的荧光素产生蓝光并激发GFP 产生绿色荧光。

优点：GFP在多种苛性条件下都很稳定，分子量小，大量表达对细胞没有毒性等特点，使其在现代细胞生物学和分子生物学研究领域的应用具有广泛前景，被喻为十分有用的活分子探针，在基因标记、基因表达控制、转基因的动植物研究、蛋白在细胞中功能的定位及蛋白间相互作用等方面有十分广泛的用途。

绿色荧光蛋白在生命科学研究中的应用

1 GFP 在建立基因转化技术及在研究基因表达方面的应用

GFP 在各种异源细胞中表达后均可检测到荧光的发射, 且对寄主细胞不存在毒性。有实验表明, GFP 在哺乳动物细胞(CHO) 内的长期(30 周) 表达对细胞的生长发育没有产生不利影响, 这表明, 它不但可以作为一个瞬时表达用的标记物, 而且也完全可以用于长久的高水平表达的标记物。

生产转基因动物的常用方法是微注射法,但其效率非常低。采用gf p 作为报道基因能有效和方便地在桑椹期及胚泡阶段检测到GFP 的表达, 从而有效地建立起转基因动物的筛选系统, Takada 的实验还表明不但GFP 本身对胚的发育无害, 同时每天用470 - 490nm 光检查对胚的发育亦没有影响。

为了检验GFP 作为外源蛋白生产时的报告物的可行性, Cha 等将GFP 和人白细胞介素( IL - 2) 在昆虫幼体中的表达特性进行了比较, 认为二者在Trichoplusia ni 幼虫中的表达特性是类似的, 这可为目标产物的表达生产提供一个模式系统(如收获时间、温度、湿度等条件的控制等) 。

Albano的实验也表明, GFP 作为异源蛋白表达的报告物具有较好的相关性。逆病毒载体已被广泛用于基因转移, GFP 也可很方便地用作逆病毒介导的基因转化标记物及在哺乳动物造血细胞中进行表达, 这将对基因治疗的研究起到促进作用。

利用GFP 亦可方便地进行转基因( transgene) 的分子生物学研究。在用wtGFP 转化拟南芥时, gf p 编码序列内的一段DNA 被宿主细胞当作自身的内含子而被切除,因而表达的GFP 蛋白也就成了无功能的蛋白, 通过对wt gfp 进行修改后, 它可以在拟南芥完成表达具功能的GFP 蛋白。

虽然GFP 在多种异源细胞中都可以表达, 但在许多植物和一些丝状真菌中表达不出有功能的GFP, 或仅能观察到GFP 的瞬间表达, 而观察不到绿色荧光的稳定表达, 关于这方面的原因还有待于进一步的探讨。

将gf p 置于含有顺式作用元件的多种序列或启动子序列的控制下, 将这些不同的基因组合转化细胞, 通过分析其荧光表达的强度, 即可判断该顺式作用元件的不同功能区作用或启动子的强弱和启动方式(组成型、组织特异型或时空型等)。

用这一方法较之gus 或cat 的优越性在于它不需固定材料和进行前处理, 同一细胞可以在不同的条件下反复进行观察。根据目前在各种生物中以各种来源启动子的GFP 表达情况来看, GFP 的表达本身是可以不受时空、组织及种属特异性等条件的限制。

2 GFP 在基因产物及基因定位研究中的应用

GFP 在接上各种细胞内定位序列(localization sequence) 后, 在活体中可直接观察各种亚细胞结构及其生活状态, 已有大量实验报道表明GFP 可定位到细胞核、线粒体、内织网、质膜及核膜孔等。各种基因突变体的产生(蛋白变小, 光强增加) 也使得定位在很小区域内的GFP 能很灵敏的检测到。

同样地, 利用GFP 可以在各种亚细胞结构中表达的特性可以研究某些序列的定位特性及分析定位序列的结构特征等, 如Kohler 等将酵母细胞色素氧化酶IV 亚基(coxIV) 的过渡肽(transit peptide) 序列接上GFP , 在植物线粒体中获得了GFP 的表达, 由此证明coxIV 在植物中具有线粒体定位序列的功能。

由于GFP 分子相对较小(2619kD) , 且它具有可以与很多蛋白融合表达而不影响各自性质的特性, 因而利用标准亚克隆技术即可将感兴趣的基因与gf p 融合, 然后将其转入感兴趣的生物体内进行瞬间或稳定表达, 这样可很方便地进行活体定位观察、蛋白质定位、细胞间的物质运输及运输的动力学研究等。为了探索Bcl - 2 家族成员在活细胞中的定位, Wolter 等将GFP 和Bax、Bcl - 2 、Bcl - XL融合后在cos - 7 和L929 中表达。

结果表明, GFP - Bcl - 2 和GFP - Bcl - XL定位在线粒体内, 具点状分布, 而GFP - Bax 则分散分布在整个细胞质中, 然而在诱导细胞凋亡的过程中, GFP - Bax 部分地定位到线粒体内而变成点状分布。如果将GFP - Bax 羧基端的疏水基团去除, 在细胞凋亡过程中就不会发生GFP - Bax 的这种重新分布和细胞死亡的加速。

由此证明了Bax 在细胞中的这种重新定位对加速细胞死亡是重要的。癌细胞中致癌基因的扩增常常是由双微染色体(DM) 介导的, 然而由于DM 比正常染色体小很多, 要在活细胞中直接观察DM 一直是不可能的, 因而也就很难开展关于控制DM 分离机制的研究。

Kanda 等将人组蛋白H2B 基因与GFP 基因融合后转染人HeLa 细胞, H2B - GFP 融合蛋白掺入到核小体而并不影响细胞周期的进程,利用共焦显微镜, 在活细胞中可以获得有丝分裂染色体和间期染色质的高分辨率图像, 在间期染色质中可观察到各种各样的染色质浓缩状态; 使用这种融合蛋白, 能够在活的癌细胞中直接观察到DM , 在分裂后期, DM 常常是簇生的, 并能在分离的子细胞间形成染色体桥。

由于胞质分裂使DM 桥割开, 从而导致DM 不均等分配到子细胞中。细胞的胞外分泌在基因工程研究中占有重要地位, GFP 与分泌蛋白Chromogranin B 相连后转染细胞, 可动态观察该分泌蛋白分泌到胞外的过程。

具活性的内皮NO 合成酶(eNOS) 在正常情况下是位于内皮细胞的高尔基复合体和细胞膜穴样内陷中, 由于突变所引起的eNOS 错误定位使NO 的生产减少, Liu 等构建了一eNOS - GFP 嵌合体, 证明eNOS 氨基端的前35 个氨基酸对于将GFP 定位到高尔基体上是充分有效的。

虽然大部分实验表明GFP 对细胞, 包括各种亚细胞结构是没有毒性的, 但亦有实验表明含GFP 的融合蛋白对细胞核有一定的毒副作用。

GFP 除了用在标记活细胞中的蛋白质外, 也可用于标记DNA , Robinett 等利用细菌lac 阻遏蛋白(lacI) 能与它的目标DNA (lac 操纵子, lacO) 紧密和特异结合, 用GFP 与lacI 构建了一融合载体可产生lacI - GFP , 他们将256 个定向重复的lacO 序列插入到CHO 细胞和酵母细胞的基因组中。

然后在活细胞中可直接观察lacI - GFP 与la2cO 的共定位地点, 利用这种技术已成功地在哺乳动物细胞、酵母及细菌中活体标记了DNA 序列和导致了细菌有丝分裂器的发现, 它的进一步应用可能涉及到染色质的结构、功能及遗传分析, 染色体的动力学及核的建成等。

将GFP (不带启动子) 转入受体细胞中, 可在不同发育时期和不同组织器官中检测报告基因的表达情况, 从而反应出该转基因整合位点附近的基因的相应表达特性, 可用来分离发育相关基因。

3 在研究病原物与宿主相互关系中的应用

关于病毒感染的检查及定位的研究目前主要采用的方法有组织印渍法( tissue printing) 、放射性标记的核酸探针法及gus 等报告基因引入病毒基因组作为报告物等, 但这些方法都必须在分析前对组织进行处理, 这样就阻止了感染的继续进行。

GFP 的出现可有效地克服这一弊端, 从而建立起一种非破坏性的检测方法(non - destructive assay technique) , 用它来跟踪病原物对宿主的感染途径, 研究病原物与宿主的相互关系, 药物的作用情况等。

将GFP与TMV 的移动蛋白MP 融合, 可用来跟踪MP 在亚细胞间的移动、监测MP 分子与宿主蛋白的关系及分离与之相互作用的成分等。Verver 等用GFP 取代虹豆花叶病毒RNA - 2 的方法充分证明了CP 和MP 对病毒的细胞间移动是绝对必需的。

Casper 等将gf p cDNA 插入烟草花叶病毒( TMV) 的基因组cDNA 克隆中, 将离体产生的可感染RNA 转录本与烟草叶片共培养, 1～2 天后用长波紫外光源照射即可观察到明亮的绿色荧光区域。

在局部组织(感染的叶片) 和系统组织(贯穿整个植株) 中都可以观察到病毒的感染和gf p 基因的表达, 在系统感染中病毒以二种方式移动: 慢速的—伴随有病毒复制和GFP 表达的细胞到细胞间的扩散, 快速的—以维管束传送的无GFP 表达方式。

Page 等通过构建一能表达GFP 的HIV - 1 重组原病毒, 通过GFP 的表达可以同时进行病毒感染和细胞表面CD4 水平的定量分析。Jons 等将gf p 基因与假狂犬病毒(PrV) 重组后感染人细胞后可用于监测病毒复制和传播的情况。