表达基因克隆技术与图谱构建策略研究

人类基因组计划的主要任务之一就是要从大片段基因组区域或整条染色体DNA 上鉴定出基因表达序列(gene expressed sequences)或转录单位(transcription units)。在人类基因组30亿个碱基对中，发生转录的表达序列(即基因)仅占总序列的3～5％。

基因组中 绝大部分是基因间隔序列(intergenic seguences)或 内含子(intron)和各种各样的重复序列。测定基因表达序列可直接鉴别人类目前认定的6～1 0万(或仅3～5万)个基因在染色体上的位置和排列顺序，这就是人类基因组计划所要构建的 第四张图谱——基因表达图谱，又称基因转录图谱(gene）

表达基因的克隆策略

基因克隆(gene cloning)是指从基因组或DNA大片段中分离并获得某一特定的基因或DNA序列，再通过DNA序列扩增形成由众多拷贝组成的一个DNA片段群体的过程。目前，广泛应用于致病基因分离与克隆的策略可归纳为位置克隆(positional cloning)、候选位置克隆(candi date positional cloning)、表型克隆(phenotypic cloning)等。

一、定位克隆

定位克隆的总体思路是疾病——染色体定位——基因序列——mRNA／cDNA——蛋 白质 (致病基因产物)。定位克隆是通过分析患病家系的连锁关系确定致病基因的遗传方式，从染 色体畸变引发的疾病入手，将染色体畸变的位置作为疾病基因克隆的一个位点进行分析的一种克隆策略

二、定位候选克隆

定位候选克隆是定位克隆的一种改进方法，是目前被认为最有发展前途的基因定位策略。人类基因组草图问世之后，所有人类致病基因将很快被定位在染色体的某个区域，这样，可从某局部的序列片段中筛选出致病基因进行结构与功能分析，这就是定位候选克隆。

1、染色体区域定位

定位候选克隆的基因区域定位多采用PCR法、FISH技术、染色体显微切割和辐射图谱等方法筛选致病基因(包括肿瘤易感基因)的基因组杂合性丢失(loss of heterozygosity,LOH)的高 频率区，从而对致病基因进行定位候选克隆。

2、致病基因的候选cDNA筛选

在致病基因被介定于狭窄的DNA重叠克隆区域的基础上，对该区域中的基因位点进行测序，将变异位点的核苷酸序列与正常序列进行比较，可确定致病基因的位置。随着区 域性 基因图谱的构建和标记位点的增多，从相互重叠的克隆群中筛选候选cDNA即筛选致病基因的 表达序列和基因定位的步伐会大大加快。

3、全长cDNA及基因结构与功能分析和鉴定

获得了大量的候选cDNA后，通过筛选cDNA文库或采用cDNA末端快速扩增(RACE)等方法克隆全长基因。确定其中致病基因的重要环节是对定位候选克隆进行功能分析，这需要对患病家系中的可能致病基因进行检测。

三、表型克隆

表型克隆策略不依赖于基因的染色体位置或基因的产物信息，只从疾病的特征出发，比较疾病DNA与正常DNA水平的差异并直接对变异的DNA进行分离。该策略是疾病基因克隆中的一种新策略。这种策略的典型技术方法是代表性差异分析(representative difference analysis, RDA)。

分离表达基因序列的技术方法

一、连锁分析与致病基因定位

当染色体上控制这些性状的基因 位点相距很近时，在减数分裂过程中位点之间发生染色体单体交叉和等位基因互换的机率较小，相邻的基因位点就有较大的机会以连锁方式传递给后代，即两位点越近，发生染色体交叉 和基因重组的可能性越小。位点间的距离用重组率或重组分数(recombination fraction . Ott J,1991)进行估计。即：重组分数＝重组配子数/（重组配子数 非重组配子数）

二、利用染色体畸变进行基因定位与分离

若发现某种疾病与染色体变异直接相关，致病基因就可定位在一段相对较短的染色体变异区域，通过连锁分析将基因分离的目标初步定位在10～20Mb区段内，使要分离的目标基因大大缩小，省去了大量繁琐的全基因组连锁分析，大大加快了该基因的定位和分离速度，再通过 筛选DNA文库、外显子捕获(exon trapping)和比较基因组杂交(comparative genome hybrid izatien)等表型策略获得致病基因。

三、cDNA选择法

基因组图谱绘制和基因定位克隆的常见问题是大片段基因组编码DNA的鉴定。为解决此问题，1991年，Parimoos 等首先提出了cDNA选择法。此法采用cDNA片段与固定在膜上的DNA进行杂交并通过PCR回收候选cDNA，用YAC、粘粒克隆扩增cDNA，进行基因组DNA大片段编码序列的迅速克隆。

四、CpG岛法

CpG岛(CpG island)是基因组DNA序列中富含C、G的DNA区域。在大规模的DNA测序中，每发现一个CG岛，意味着在此有一个基因。利用CpG岛稀有酶如SacⅡ、BssHⅢ、Eag Ⅰ、HpaⅡ、NotⅠ识别其位点，切割基因组DNA。CpG岛又称HIF岛，即用HpaⅡ酶将CpG岛周围 的DNA切成许多小片段，这些序列称为HIF序列。用位于CpG附近的序列作探针，从总DNA文库 或cDNA文库中得到转录子，鉴定表达基因。

五、基因表达序列分析(Serial analysis of gene expression,SAGE)

特点：Velcule scu VE 等(1995)率先提出的一种分析基因表达的新策略，其主要特点是能在短期内采用PCR或手动测序等通用仪器得到大量的表达信息，并能对不同状态下的表达基因进行定量和定性的检测，比较完整地直接读出基因表达的信息，因此，SAGE技术在研究表达基因测序上有较大的 发展潜力。与cDNA选择法相比，基因序列表达分析能减少大量的重复测序，大大节省研 究时间和费用。

六、动物基因组印迹杂交

动物基因组印迹杂交(Zoo blot)是基于人类及其他动物在长期进化中普遍存在基 因的同源和保守序列的理论设计的。该方法采用同一基因单拷贝的分子探针与各种动物的基 因组DNA作Southern印迹杂交筛选，如果杂交表现为阳性，表明所用的探针中可能包含进化 过程中的保守序列，即序列间有很高的同源性，该序列可能是外显子或编码表达基因区域， 进而分离基因组中的表达序列。

七、基因差异表达

生物体在不同发育阶段、不同生理状态下、不同类型细胞或组织中的结构与功能 的变化的差异归根结底是基因在时间与空间上的选择性表达差异，即为基因的差异表达。

基因差异表达的研究策略主要建立在基因转录和翻译的调控过程中，即mRNA差异或cDNA差异 和蛋白质差异两个水平，研究较多的是mRNA或cDNA水平。