【共享】DNA提取中常见问题

Q1: 抽提DNA 去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好?

A1: 酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变 性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。

作为表面变性剂的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10%-15%的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA ，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA 。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。

经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿1:1混合使用。

Q2：为什么用酚与氯仿抽提DNA 时，还要加少量的异戊醇?

A2：在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中 的泡沫产生。

一般采用氯仿与异戊醇的比例为24:1。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25:24:1，同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。

Q3：植物基因组DNA提取时遇到多糖成分的干扰，DNA提取纯化质量一直不高，如何消除多糖的影响？

A3：一般来说，SDS法提取的DNA会还有较多的多糖，使DNA成胶冻状。而CTAB DNA提取纯化法可基本上除去多糖。如果是植物材料本身含糖量比较高，可尝试以下方法：

1、在DNA未溶出之前，先用一些缓冲液洗去多糖。可用缓冲液如：100 mmol/L Tris –HCl (pH=8.0)、5 mmol/L EDTA和0.35 mol/L Sorbitol。

2、使DNA提取液中的多糖先沉淀。在提取液中加入0.35倍体积的无水乙醇，迅速混匀，多糖会先沉淀。

3、沉淀DNA时，使多糖保留在溶液中。如用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5 mol/L NaCl，或加NH4Ac使终浓度为 10 mmol/L；或0.5 ml DNA液中加5 ml 4 mol/L NaCl 和 0.625 mL 13% PEG 8000（冰浴 1 h）。

4、多糖和DNA的共沉淀物进行再分离。如用TE缓冲液反复清洗共沉淀物，将清洗液合并再用醇沉淀DNA，或将沉淀物溶解后，经琼脂糖电泳，切下DNA部分再将胶回收，或者用多糖水解酶将多糖降解。

Q4：为DNA提取纯化实验需准备哪些试剂？

A4：Tris饱和酚、氯化钾、蛋白酶K、100 bp DNA Ladder、DL2000 DNA Marker和SNP服务等。

Q5：采用内源核酸酶含量丰富的材料进行基因组DNA提取时，怎样更好的抑制内源核酸酶的活性？

A5：采用内源核酸酶含量丰富的材料进行基因组DNA提取时，可增加裂解液中螯合剂的含量，细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔。

Q6：洗涤产物中DNA量很少或没有可能有哪些原因？

A6：

1、样品中细胞或者病毒浓度低；

2、裂解液和样品混合不均匀造成细胞的裂解不充分；

3、蛋白酶K活性下降造成细胞裂解的不充分；

4、温浴时间不够造成的细胞裂解不充分或蛋白降解不完全；

5、在上柱前，裂解物中没有加乙醇，或用低浓度乙醇代替无水乙醇；

6、DNA没有有效洗脱；