DNA提取中的常见问题分析

提取植物DNA时遇到多糖成分的干扰， DNA质量一直不高，如何消除多糖的影响？

参考见解：一般来说，SDS法提取的DNA会还有较多的多糖，使DNA成胶冻状。而CTAB法提取可基本上除去多糖。如果是植物材料本身含糖量比较高，可用以下方法试一试：

1、 在 DNA 未溶出之前，先用一些缓冲液洗去多糖。如可用缓冲液：100 mmol/LTris -HCl(pH=8.0)、5 mmol/L EDTA和0.35 mol/L Sorbitol洗几次。

2、 使 DNA 提取液中的多糖先沉淀。在提取液中加入 0.35 倍体积的无水乙醇，迅速混匀，多糖会先沉淀。

3、 沉淀 DNA 时，使多糖保留在溶液中。如用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入 1/2 体积的 5 mol/L NaCl，或加 NH4Ac 使终浓度为 10 mmol/L。或 0.5 mL DNA 液中加 0.12 5 mL 4 mol/L NaCl 和 0.625 mL 13% PEG 8000（冰浴 1 h）。

4、 多糖和 DNA 的共沉淀物进行再分离。如用 TE缓冲液反复清洗共沉淀 物，将清洗液合并再用醇沉淀 DNA，或将沉淀物溶解后，经琼脂糖电泳，切下 DNA 部分再将胶回收，或者用多糖水解酶将多糖降解。还 有在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用而去除多糖 。

上述方法还可组合使用，以达到最佳效果。然而这些方法均会在一定程度上减低 DNA 的提取量；如果材料较少或要求较高，则可考虑用柱层析方法，使用对 DNA 具有 特异性吸附的树脂来纯化 DNA。曾有文献提到选用 Wizard Purification Kit，PRC-5 柱 ，Sephacryl S-1000 或 S-500，Qiagen Genomic tip 500/G ，或者 CsCl 梯度离心纯化 DNA。

血样4度保存了2月，现在按照酚常规提取方法不能提取出DNA，有什么解决办法？

参考见解：按照常规的酚/氯仿法不可能提不出来，下面是参考方法：

1、 首先洗出白细胞，最好有1毫升以上血液。

2、 加入5ml DNA提取缓冲液，(10m mol/L Tris-cl, 0.1 mol/L EDTA, o.5% SDS),混匀。

3、 加入25ul 蛋白酶K ,使终浓度达到100ug/ml, 混匀，50℃水浴过夜。

4、 用等体积的（酚，氯仿，异戊醇，25：24：1）混合物抽提一次，5000r/min，10min离心收集水相。

5、 取水层，加入3倍体积-20℃预冷无水乙醇5000r/min，10min，75%乙醇5000r/min洗DNA，充分干燥将DNA溶于适量水中。

CTAB法提取水稻基因组DNA， TE 溶解后琼脂糖胶电泳检测，点样孔附近有一条明显的主带。用MBI 公司产的限制性内切酶酶切过夜，鉴定时发现DNA已经被完全切烂，只在溴酚蓝前存在微弱smear状产物。换用NEB 公司产的酶，更换EP管，灭菌水之后重复几次，结果还是如此。拿其他人的DNA 做对照，酶切结果正常。用异丙醇将DNA 重新沉淀，换了TE溶解，检测主带仍旧清晰，可是用酶切之后DNA还是被切烂。为什么？

参考见解：

1、 公司的酶不行。

2、 如做酶切，DNA最好不用异丙醇（因其不易挥发）而用无水乙醇沉淀。

3、 酶量大或作用时间太长了。

建议重提DNA，取少许用超纯水溶解（非TE），按照说明书进行酶切。要用新鲜样品或液氮冷冻-70度保存的样品。这样通过降低内切酶的活性减少DNA的降解；

要得到全血基因组DNA，可以先用分层液密度梯度离心将淋巴细胞分离吗？这样做，与沉淀全血细胞然后破坏红细胞得到的结果有何差异？

参考见解：

1、 觉得还是先分离细胞好，因为DNA和RNA大都是在细胞核内，有红细胞反而不太好。从血里面提RNA，用淋巴细胞分离液先分离有核细胞的，效果还是不错的。

2、 现在提取全血的DNA,也就是提取淋巴细胞中的DNA，用密度梯度离心，只是富积淋巴细胞，能得到更多的DNA而已。一般如果DNA的量的要求不太多的话，没必要。

3、 如果对基因组的要求不高，可以试试这个方法。取EDTA-Na2抗凝血100μl加至1.5ml Eppendorf管中，加无菌重蒸水500μl；10 000r/分钟离心3分钟，弃净上清；加20μl 5mol/L KI，旋涡振荡30秒;0.9%NaCl 100μl,150μl氯仿/异戊醇(24∶1)，振荡30秒；10 000r/分钟离心5分钟，吸上清100μl于另一Eppendorf管中，加异丙醇60μl，轻轻混匀，10 000r/分钟离心5分钟，弃上清；加冷无水乙醇1000μl，10 000r/分钟离心5分钟；弃去无水乙醇，37℃烤干；50μl无菌重蒸水或TE，混匀溶解备用。

从经福尔马林处理后的组织标本中提取DNA可以吗？

参考见解：可以的，国外有好多相关试剂盒，qiagen, roche等公司都有的。

100ml的大量提取，蛋白酶Ｋ是必需的吗？它的作用是什么？用溶菌酶代替可以吗？每次在用酚氯仿异戊醇抽提后，上层里面都是絮状的蛋白质，离心几次都沉淀不下来，请问是哪里出了问题？

参考见解：一般来说，蛋白酶的作用是将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。而溶菌酶的作用是破坏微生物细胞壁，二者作用各异，不可替代。对于实验中的蛋白问题，建议离心后先用竹签挑出蛋白，小心吸取上层清液，再重复抽提几次试试。

一般植物DNA提取的时候都不加蛋白酶K，这样提出来的DNA链上的组蛋白等未被蛋白酶消化，不是很难除去吗？那DNA是不是不纯？可以用来酶切吗？

参考见解：蛋白酶k的主要作用并不是消化组蛋白，而是消化细胞，在动物细胞DNA的提取也不加蛋白酶k也是可以的，植物细胞的较易破碎，不需要蛋白酶k的作用。protenase K作用：

1、 消化组蛋白，释放出DNA。

2、 消化DNAse，提高DNA分子量。

建议还是加蛋白酶k为好，这样提出来的 DNA分子量会高一点，且更纯。

提白粉孢子的总DNA，白粉孢子比较小，直接在研磨中加液氮研磨可以吗？

参考见解：液氮研磨的方法应该可行的，做动物组织，植物组织多采用这种方法，植物纤维一样可以用液氮研磨，要有耐心，边加液氮边研磨，研磨好后再抽提，应该是可以的。

在CTAB法提取DNA时，有一些品种没有DNA析出，是什么原因？

参考见解：

1、 用预冷的异丙醇来沉淀试试，同时研磨的时候要研的非常非常的细。

2、 没有看到析出物并不代表没有沉淀，可以继续下一步试验，溶解的时候少加一点儿。

3、 高离子强度下DNA与CTAB能形成共沉淀。可能DNA就这样留在沉淀里了。

提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，怎样更好的抑制内源核酸酶的活性？

参考见解：在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时,可增加裂解液中螯合剂的含量,细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔。

用试剂盒对农田土壤的的微生物群落DNA进行提取，虽然总DNA提出来了，可是用细菌的通用引物进行PCR的时候却怎么也扩不出来，请有没有什么好的办法可以解决这个问题？

参考见解：环境特别是土壤的样品成分复杂，尤其是有腐殖酸具有和DNA类似的性质，因此用一般的国内试剂盒无法提纯。应当选用自制的提取方法，在裂解液中加入要加入PVP。

洗涤后硅胶膜上仍有杂色残留？

参考见解：细胞裂解不充分，裂解液和样品要快速充分混匀。

洗涤产物中DNA量很少或没有？

参考见解：

1、 样品中细胞或者病毒浓度低。

2、 裂解液和样品混合不均匀造成细胞的裂解不充分。

3、 蛋白酶K活性下降造成细胞裂解的不充分。

4、 温浴时间不够造成的细胞裂解不充分或蛋白降解不完全，尽量把组织切成小块，延长温浴时间，使裂解物中没有颗粒状物残留。

5、 在上柱前，裂解物中没有加乙醇，或用低浓度乙醇代替无水乙醇。

6、 DNA没有有效洗脱，提高洗脱效率，可将离心柱在加入洗脱液后在室温静止至少1min，再离心。

7、 洗脱液pH不合适，低pH值会减少DNA产率，确保洗脱液pH在7.0－8.5之间。8洗脱体积太大，超过200ul洗脱体积所得的DNA浓度会降低，但DNA总量不会减少。

A260/280比值较低？或者A260/280比值较高？

参考见解：用水作为洗脱液比较偏低，或者蛋白质残留，但如果操作过程中使用了苯酚，则更可能是苯酚残留。而比较高可能是大量RNA残留，没有使用RNaseA，或RNaseA活性下降。A260 值提示的含量与电泳检测时提示的含量有可见的误差则为苯酚残留。

DNA影响后续酶反应试验？

参考见解：

1、 在洗脱液中有残留的漂洗液GW，可通过再次的离心去除硅胶膜上的GW。

2、 大量RNA残留。

在缓冲液GA GB 中有白色沉淀？

参考见解：白色沉淀可能使由于低温或长时间放置产生，可在使用前在56℃重新加热融解。

在操作中加入缓冲液GB有白色沉淀？

参考见解：在缓冲液GB加入后产生的白色沉淀在70℃温浴时会消失，不会影响下游的操作。

CTAB法提取DNA,CTAB为什么要预热？

参考见解：

1、 CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出,因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于15℃。

2、 促进CTAB更好的溶解，以提高其释放植物组织中DNA的效率，先达到了反应温度，这样实际作用时间要比不预热短一些。

在用CTAB法提取玉米嫩叶DNA，所取到的DNA为什么是黄色或黑色而不是呈白色？

参考见解：

1、 可能是色素的问题，不同的材料会出现不同的颜色，用这些应当可以P出来东西。

2、 你取样的时候带上了别的东西 ，或者洗涤的时候没有洗干净。

CTAB法抽提DNA，95％的乙醇沉淀后，用1/10体积3mol/L的NaAc（pH5.2）和1体积的76％的乙醇洗涤后，自然晾干后加65度的TE（pH8.0），TE的量并不少，可总是溶的不好，什么原因？

参考见解：不能溶解不要紧，离心机大力离心后取上清，加入无水乙醇沉淀后在用TE重悬，提取的DNA要纯些。也可以吸取溶解了的TE液加入异丙醇再次沉淀。

用CTAB法抽提的，CTAB和DTT（二硫苏糖醇）混合后加入磨碎的叶子中，65度30分，后用氯仿/异戊醇去蛋白，吸上清加异丙醇，但没有看见DNA，叶子的量很多，取的是四叶期最老的叶子。为什么？

参考见解：老叶子破壁困难，DNA难以释放出来。

1、 尽量磨细叶片，最好用液氮反复几次研磨为粉末状；

2、 延长CTAB的作用时间，期间不时摇匀。

也可能由于叶子量太大，而CTAB量少，导致得到的液体粘稠，无法混匀，细胞破裂不完全，DNA少；可试着用大的离心管，多加入CTAB，65度温浴并不时地摇匀。

抽提过程中的现象及可能的原因？

参考见解：

1、 核酸不溶解或者难溶解 – 蛋白质残留 (虽然目前更多的资料强调的是过分干燥所致。)。75% 乙醇洗涤后，如果是空气干燥，几乎不可能过分干燥的，尤其是在南方潮湿的地方。佐证实验：撕取少量 Merck 的丝状CT DNA 到一个离心管中，加入无水乙醇；10 分钟后彻底去除乙醇；待乙醇完全挥发后，加入 TE，10 分钟后溶液就非常均匀而粘稠了。

2、 使用异丙醇沉淀核酸，沉淀为白色 – 多糖残留。

3、 核酸溶解后为乳白色 – 多糖残留。

4、 75% 乙醇洗涤异丙醇沉淀的核酸时，沉淀变大了。

降解的现象、原因及对策？

参考见解：降解的现象，如果抛开问题电泳所致，可以简单总结如下：主带不再突出，向小片段方向发生弥散，亮度比较均衡地衰减。如果同时还伴随下列的一个或者多个现象，则需要更进一步的检测：加样孔非常的亮、弥散发生在主条带位置的上下两个方向、从加样孔即开始发生弥散。以现在的裂解液的裂解能力而言，降解的发生主要是在彻底匀浆之前，只有极少量由不干净的溶解液导致。以总 RNA 抽提为例，本站就有帖总结为：总 RNA 的质量由高到低依次为悬浮细胞、贴壁细胞、组织 (此处的质量不仅指纯度，也指完整性才对)。彻底裂解悬浮细胞的时间最短，彻底裂解组织的时间最长，这就是降解多发生在彻底匀浆之前的一个佐证。再看一看新鲜样品和冷冻保存样品，非常严格的冷冻保存和匀浆操作的确可以确保冷冻样品的核酸的质量；但是，有许多实验室并不具备严格的保存手段，实验人员的操作也并非完美，其结果就是核酸的降解。

RNA 抽提受的影响因素太多，就以基因组 DNA 的抽提为例看一看吧。假定消化使用的是含蛋白酶 K 的溶液，无论你使用的是新鲜样品还是冷冻保存样品，如果混匀彻底，可以预期的降解为：细胞 – 不应该降解，碾碎的组织 – 不应该降解，大块组织 (包括鼠尾) – 部分降解。如果电泳发现新鲜的细胞和碾碎的新鲜组织发生了降解现象，该现象是假象；如果电泳发现冷冻的细胞和碾碎的冷冻组织发生了降解现象，该现象不是假象，就是样品在保存中已经降解了。说得更极端一点，即使蛋白酶 K 失活了，消化试剂的裂解能力也足以保证细胞的基因组 DNA 在抽提过程中间不被降解。减少或者杜绝核酸降解，一定要将重点放在样品被彻底匀浆之前。样品的保存在前面已经说过了，不重复。其次就是要缩短样品从脱离原来的生存环境或者低温到被彻底匀浆之间的时间。

后续酶反应失败？

参考见解：首先从资料书中着手。如果三次实验后，问题还没有解决，那么 90% 的可能在于洗涤方式的不严格导致的小分子物的残留。小分子物像刀，可以陆续“杀”死很多酶；大分子物如蛋白质，像绳子，只能“捆住”一个目的核酸或者酶。更严格的洗涤可以解决该问题。

蛋白质是如何残留的？

参考见解：

1、 PC 纯化：a-取上清时取到中间层及下层；b- PC 用量不足；c-混匀不彻底；d-溶解于上清中的少量 PC 中含有的蛋白质。

2、 高盐沉淀：a-取上清时取到了蛋白沉淀；b-裂解不彻底；c-裂解液用量不足，使裂解体系太粘稠；d-溶解度问题 (可以使用低温沉淀加以改善)。介质：a-裂解不彻底；b-裂解体系太粘稠。

小分子物质 (苯酚、盐) 是如何残留的？

参考见解：

1、 醇沉淀：洗涤不彻底。其原因与管子、操作手法等有关。

2、 介质：颗粒状介质的原因与醇沉淀相同。柱式的几乎都是柱子设计上的缺陷所致，极少数由操作者未严格按要求操作所致。

核酸抽提中的温度问题？

参考见解：核酸抽提中的温度问题，也是一个值得关注的问题。首先要明确的一点是，任何一个温度条件，对某些方面有利，同时也一定会有不利的一面。如沉淀，低温操作会提高得率，但也会增加杂质的残留。任何一步操作该用什么温度为好，应该是利弊权衡的结果。基本上，除了一些特殊的步骤，如消化等外，用室温是最好的选择。那些认为“低温操作可以防止或者减少降解”之类的理由，并没有多少可操作性的。低温的确可以减低酶的活性，但低温同时也降低了这些酶被裂解液中的试剂灭活或者抑制的速度，此消彼长，没有办法给出结论的。就 RNA 抽提而言，彻底匀浆前在冰上操作可以降低 RNA 被降低的风险，彻底匀浆后的温度对 RNA 的完整性影响已经不会大的；如果发现影响很大，说明 RNase 没有被裂解液有效抑制，提示裂解液的用量不足。更没有道理的是认为低温沉淀和低温洗涤可以防止降解了。事实上，核酸一旦被沉淀下来，对酶的耐受力是很强的，这就是核酸保存在醇溶液中最稳定的理论基础。如果说沉淀使用低温还可以提高得率，洗涤使用低温又是为什么？彻底的错误而已。

吸取上清的问题中，如果提取植物基因组DNA的话，用1ml的大枪头吸有问题吗？因为怕断裂，用的滴管吸的，但是操作起来不太方便（做southern用）”

参考见解：1ml tip 能造成的断裂 (如果不是反复抽打的话)，绝对在 20kb 以上。

提取结束的基因组DNA到底是否要用TE溶解？因为后面还要做SOUTHERN的酶切反应，但是很多资料上都显示用TE溶解？

参考见解：T10E1 溶解的 DNA 是不会对酶切产生可见的抑制的；如果非常担心，可以使用 T10E0.1 溶解之。事实上，如果 DNA 在 1 周内会用于实验，单独使用 Tris （10mM) 溶解也没有问题。