小麦线粒体DNA的高效提取方法

李文强, 张改生, 汪奎, 牛娜, 潘栋梁

西北农林科技大学 陕西省作物杂种优势研究与利用重点实验室, 杨凌 7121 00

摘要: 以小麦黄化苗为材料, 通过简单差速离心、DNaseⅠ处理得到无核DNA 杂质的线粒体, 用SDS 和蛋白酶K 裂解线粒体, 经酚/氯仿抽提除去蛋白, 并用RNase A 消化而得到单纯线粒体DNA(mtDNA)。

对所提取的mtDNA 进行紫外吸收光度分析, A260/A280 平均为1.92, A260/A230 平均为2.09, 平均每克黄化苗可提取mtDNA 26.85 μg; 并对mtDNA 进行琼脂糖凝胶电泳和RAPD 扩增, 均得到清晰的电泳图谱。

结果表明: 此提取方法得到的mtDNA, 不但产率高、结构完整, 而且能有效去除核DNA、RNA 和蛋白质等杂质, 获得高质量的mtDNA用于PCR 反应和各种遗传学分析。

研究还发现, 通过调整线粒体裂解温度(先50℃裂解1 h, 再37℃裂解1 h), 亦可大幅度提高mtDNA 的产率。 （实验频道 ）

关键词: 小麦; 线粒体; mtDNA; 提取方法; RAPD

An efficient method for isolation of mitochondrial DNA in wheat
LI Wen-Qiang, ZHANG Gai-Sheng, WANG Kui, NIU Na, PAN Dong-Liang
Key Laboratory of Crop Heterosis of Shaanxi Province, Northwest A %26amp; F University, Yangling 712100, China Abstract: An efficient method for isolation of mitochondrial DNA (mtDNA) from etiolated tissues of wheat was developed.The protocol consists of mitochondria isolation with differential centrifu gation, Dnase I treatment, lysis with SDS and proteinase K, removing protein by TE-saturated phenol/chloroform extraction and a final RNase A treatment for obtaining mtDNA. The mtDNA samples were tested using spectrophotometry and agarose gel electrophoresis. It was proved that the mtDNA isolated by this method not only have the high yield but also structural complete, and contains no impurities, such as nuclear DNA, RNA and protein. The result showed that this high quality mtDNA can be successfully used in PCR and other genetic studies. In addition, it was found that adjusting the lysis temperature has a noticeable effect on the mtDNA yield.
Keywords: wheat; mitochondria; mtDNA; isolation method; RAPD

线粒体是植物细胞重要的遗传系统之一, 提取高质量的线粒体DNA(mtDNA)是对线粒体遗传系统进行深入研究的基本前提, 也是开展植物细胞质雄性不育分子机理研究的先决条件。

被称为生物界“哥德巴赫猜想”的细胞质雄性不育(CMS), 经国内外众多科学家近半个世纪的研究, 许多结果发现是由于花粉发育过程中线粒体正常呼吸代谢受阻, 从而导致小孢子败育[1~3], 而线粒体正常呼吸代谢受阻,多是由于线粒体呼吸链中蛋白编码基因表达异常引起[4, 5]。

由于线粒体呼吸链蛋白是由核DNA 和线粒体DNA(mtDNA)共同编码, 因此发生在DNA 水平的线粒体遗传系统或核遗传系统的结构, 或者功能的改变均可引起线粒体呼吸代谢异常, 并导致细胞质雄性不育[6~8], 即细胞质雄性不育是质核互作的结果。

植物mtDNA 大多数为环状分子, 每个线粒体中DNA 分子数从几拷贝到几十拷贝不等, 且不同物种mtDNA 分子大小差别也很大, 从几十kb 到几千 kb 不等, 所以对于不同物种其mtDNA 提取方法很难统一。

但总体来看, 植物mtDNA 提取方法, 主要有密度梯度离心[9, 10]和差速离心[11, 12] 等方法; 密度梯度离心得到的线粒体DNA 虽纯度高, 但操作复杂、耗时, 而且对材料的需求量大, 同时mtDNA 产率低, 且长时间高速离心对离心机亦要求很高; 普通的差速离心虽然操作简单, 但所提取的mtDNA纯度低、易降解, 以及核DNA、RNA 和蛋白质等杂质污染严重, 不能满足后续研究工作的需要。

本文以小麦黄化苗为材料, 建立了一套高效的小麦mtDNA 提取方法, 所提取的mtDNA 具有结构完整、纯度和产率高, 能完全满足PCR 分析、基因定位、克隆等分子操作的需要。

1 材料和方法

1.1 材料

供试材料分别为小麦近缘种属的一些山羊草、对应山羊草细胞质的小麦异源细胞质雄性不育系、其它普通小麦变种细胞质雄性不育系, 以及由这些不育系与对应恢复系组配的F1 杂种。

(1) 山羊草: 粘果山羊草(Ae.kotschyi), 易变山羊草(Ae.variabilis), 偏凸山羊草(Ae.ventricosa), 二角山羊草(Ae.bicornis);

(2) 小麦细胞质雄性不育系: ms(Ae.kotschyi)- 90-110, ms(Ae.variablis)-90-110, ms(Ae.ventricosa)- 90-110, ms(Ae.bicornis)-90-110, ms(T.aestivum)-77(2), ms(T.spelta)-77(2), ms(T. timopheevii) -77(2), ms(T.aestivumPrim epi)-77(2);

(3) 不育系与恢复系组配的杂种F1: ms(Ae. kotschyi)-90-110×5253, ms(Ae.variablis)-90-110×5253, ms(Ae.ventricosa)-90-110×5253, ms(Ae.bicorni s)-90-110×5253, ms(T.aestivum)-77(2)×T6-3, ms (T.spelta)-77(2)×T6-3, ms (T. timopheevii)-77(2)×T6-3, ms(T.aestivum Primepi)-77(2)×T6-3;

(4) 保持系: 90-110, 77(2);

(5) 恢复系: 5253, T6-3; 其中保持系和恢复系均为普通小麦品种。
以上种子用5%次氯酸钠表面消毒10 min, 蒸馏水冲洗干净后室温下浸泡12 h 左右, 挑选已露白的种子铺于无菌滤纸上, 室温下避光培养7~10 天,收取黄化苗。（实验频道 ）

1.2 方法

1.2.1 线粒体的提取

称取1~10 g 黄化苗, 加入5 倍体积预冷的匀浆缓冲液A(50 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 1.3 mol/L NaCl, 25 mmol/L EDTA, pH 8.0, 0.2% BSA, 使用前加入0.05%半胱氨酸和0.5%β-巯基乙醇)。

用预冷的研钵或匀浆捣碎机充分破碎组织, 经6 层纱布过滤, 滤渣加入3 倍体积的匀浆缓冲液A 继续破碎, 两次滤液合并后分装于15 mL 离心管。将滤液用 Eppendorf 5810R 高速冷冻离心机1, 000 g 离心10 min; 取上清液2, 000 g 离心15 min, 并重复此步操作。

将得到的上清液18, 000 g 离心15 min, 弃上清, 得到粗线粒体沉淀。向每管沉淀中加入5 mL 预冷的匀浆缓冲液A, 并将沉淀重悬浮, 18, 000 g 离心15 min, 充分弃掉上清液, 得到较纯的线粒体沉淀。

向沉淀中加入1 U/μL DNaseⅠ(Fermentas)5 μL, 10× buffer 10μL, 超纯水85 μL, 充分混匀后37℃温育1 h, 加入10 μL 0.5 mol/L EDTA, pH 8.0, 混匀后静置 10 min 以终止反应。

然后加入2 mL ST 缓冲液(400 mmol/L 蔗糖, 50 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 0.1% BSA), 18, 000 g 离心15 min, 弃掉上清, 沉淀为无核DNA 杂质的线粒体(以上所有操作除特别说明外均在4℃以下或者冰浴中进行)。

1.2.2 mtDNA 的提取

向每管线粒体沉淀中加入1 mL 裂解缓冲液 B(25 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 20 mmol/L EDTA, pH 8.0, 0.5% SDS), 并加入蛋白酶K(Meck)至终浓度为100 μg/mL。将沉淀充分悬浮, 先50℃裂解1 h, 再37℃裂解1 h, 裂解期间每隔一段时间轻轻摇动一次。

裂解结束后加入2 mol/L 醋酸铵100 μL, 并加入1 mL TE 饱和的酚/氯仿(1:1)抽提, 充分混匀, 静置10 min, 18, 000 g 离心5 min, 吸取上清, 并重复抽提一次。

小心吸取上清, 将其分装于1.5 mL 离心管中, 并加入无DNase 的RNase A(Sigma)至终浓度为20 μg/mL, 37℃温育0.5~1 h, 然后加入2 倍体积的无水乙醇, 充分混匀, －70℃静置1 h, 18, 000 g 离心15 min, 所得白色mtDNA 沉淀在室温下干燥后加入 10~30 μL TE 溶液, 可于－20℃保存.

1.3 mtDNA 的质量及纯度检测

(1) 取2.5 μL mtDNA 溶液, 加超纯水稀释至50 μL,用Eppendorf Biophotometer 紫外分光光度计分别测定A260/A280、A260/A230 及mtDNA 浓度, 并进行纯度分析。

(2) 取7 μL mtDNA 样品与1.5 μL 上样缓冲液混匀,0.8%琼脂糖凝胶电泳(4 V/cm)50 min, 用GeneGenius GBox-HR 凝胶成像系统照相检测mtDNA。

1.4 RAPD 扩增

用25μL 反应体系进行PCR 扩增, 反应体系含有模板mtDNA 25 ng, 2.5 mmol/L dNTPs 1 μL, 10×buffer 2.5 μL, 25 mmol/L MgCl2 2 μL, 5 U/μL Taq DNA聚合酶(Fermentas)0.3 μL, 10 umol/L 随机引物1 μL,剩余体积用超纯水补足。

PCR 反应在MyCyclerThermal Cycler(Bio-Rad)上进行, 反应程序如下; 95℃预变性3 min; 94℃变性1 min, 37℃复性1 min, 72℃延伸2 min, 45 个循环; 72℃延伸5 min。 扩增产物经1.5%琼脂糖电泳检测。

2 结果与分析

2.1 mtDNA 紫外吸收光度分析

从紫外吸收光度测定结果(表1)可见, 本方法提取的mtDNA纯度高, 其A260/A280 介于1.8~2.0, 表明样品中无蛋白质或酚类污染; A260/A230 平均为2.09, 表明样品中基本不含有机试剂等干扰; 样品平均浓度为 2.24 μg/μL, 平均每克黄化苗可提取mtDNA 26.85 μg。（实验频道 ）

表1 mtDNA 紫外吸收光度测定结果
Table 1 Results of spectrophotometry of mtDNA

2.2 mtDNA 的琼脂糖电泳检测结果

最近研究表明[13], 小麦线粒体全基因组为452, 528bp 的环形DNA 分子, 由于其分子质量较大, 要想获得完整的mtDNA, 提取操作中应格外小心, 以防mtDNA 的降解或断裂。用本方法所提取的mtDNA 经琼脂糖电泳检测, 没有降解, 条带清晰(图1:a)。

此外, 用黄化苗提取mtDNA 时, 核DNA 和RNA 对mtDNA 纯度有很大影响, 在对线粒体进行裂解前若未用DNaseⅠ消化处理, 所提取的mtDNA 中有细胞核DNA 杂质, 电泳泳道会有明显拖尾现象; 由于黄化苗组织中所含RNA 也比较丰富, 所提取的mtDNA 若未用 RNase A 处理, 电泳图中明显可见有RNA混杂(图1: b)。

a:1. ms(Ae.kotschyi)-90-110; 2. ms(Ae.variablis)-90-110; 3. ms(Ae .ventricosa)-90-110; 4. ms(Ae.bicornis)-90-110.b:1.用RNase A 和Dnase I 处理过的mtDNA; 2. 未用RNase A 处理的mtDNA; 3.未用DNaseⅠ处理的mtDNA。

2.3 mtDNA 的RAPD 分析

用随机引物OPY-01(5′-GGTGGCATCT-3′)对24个材料的mtDNA 进行RAPD 扩增, 平均每个材料可扩增出5~9 条带, 扩增片段介于250~4,250 bp, 其中Ae.kotschyi、ms(Ae.kotschyi)-90-110、ms(Ae.kotschyi)-90-110×5253 之间存在多态性, 这种多态性为研究小麦细胞质雄性不育机理可提供翔实的线粒体变异的资料。

2.4 影响mtDNA 产率的因素

影响提取产率的最主要因素是线粒体的裂解程度, 试验过程中通过改变裂解缓冲液B 中蛋白酶K和SDS 浓度、裂解时间等条件, 未发现所提取的mtDNA 样品产率有显著变化。

线粒体裂解时, 在裂解温度为37℃或50℃恒温裂解2 h, 发现对mtDNA 的产率影响不大, 平均每克新鲜的黄化苗分别可提取mtDNA 6.84 μg 和5.52 μg; 但在其他裂解条件不变的情况下, 先50℃恒温裂解1 h, 然后立即改变裂解温度至37℃再裂解1 h, 所得到的mtDNA 沉淀明显增多, 经测定平均每克新鲜的黄化苗可提取mtDNA 26.85μg(表2)。

初步分析可能是温度的急剧改变引起线粒体膜破裂程度发生改变, 从而引起mtDNA 从线粒体膜内部更多地释放出来, 因此线粒体裂解更充分。

3 讨 论

为了获得高质量的mtDNA, 通常需要一系列操作步骤以去除蛋白质、次生代谢物、糖类小分子、核DNA 和RNA 等杂质, 用传统提取方法经过这些操作后所得到的mtDNA, 无论是完整度或提取产率方面均受到很大的影响。

本研究以小麦黄化苗为材料, 通过差速离心、DnaseⅠ处理、线粒体裂解、酚 /氯仿抽提和RNase A 消化等主要步骤, 所提取的 mtDNA 结构完整、产率高, 不仅适合限制性酶切分析等对mtDNA样品需求量较大的研究, 而且适合对 mtDNA 纯度、完整度要求高的PCR 扩增。

与传统的提取方法[10~12]相比, 本方法所提取mtDNA 不但纯度高、无降解、电泳谱带清晰, 而且具有以下优点;

(1)在提取过程中, 用DNaseⅠ和RNase A 进行消化, 可排除mtDNA 中的核DNA 和RNA, 能保证后续分子操作的可靠性;

(2)在线粒体裂解过程中, 通过调整裂解温度(先50℃裂解1 h, 再37℃裂解 1 h), 从而大大提高了mtDNA 的产率。此外, 用本方法从二角山羊草的成熟叶片中提取mtDNA, 也获得了很好的效果。

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