对一些DNA提取方法的总结

互联网2013-09-06

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有时候提DNA不是很顺，所以提出来大家讨论一下，因为我是做微生物的，我首先提供一下关于微生物的DNA 提取方法，大家觉的有可以改进的地方，欢迎讨论！！ 细菌DNA的提取 ： （一）试剂： 1. 抽提缓冲液 2% CTAB (W/V) 2% PVP K25 (w/v) （去色素） 100 mM Tris-HCl (pH8.0) 25 mM EDTA (pH8.0) 2.0 M NaCl 2. 10 M LiCl 3. 2 M LiCl 4. DEPC-water（抑制RNA酶活性） 5. 3 M NaAc (pH5.2) 6. 96% 乙醇 7. 70% 乙醇 步骤： 1. 抽提缓冲液65 ℃预热； 2. 加菌体到已经预热的缓冲液（700 ul）中混匀，65 ℃，10 min； 3. 加酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡，离心12,000 rpm，10 min； 4. 取上清，加氯仿/异戊醇（24：1）振荡，离心12,000 rpm，10 min； 5. 取上清，重复4步骤； 6. 加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙醇），－2 ℃沉淀； 7. 离心12,000 rpm，10 min； 8. 弃上清，70％乙醇洗，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于100 ml 水中。 (二)（我们常用的方法，但是有时有些细菌特别不好提，就用上面的方法） 1. 将菌株接种于液体LB培养基，37 ℃震荡培养过夜。 2. 取1.5 ml培养物12000 rpm离心2 min。 3. 沉淀物加入567 ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30 ul 10%SDS和15 ul的蛋白酶K，混匀，于37 ℃温育1h. 4. 加入100 ul 5 mol/L NaCl, 充分混匀，再加入80 ul CTAB/NaCl溶液，混匀后再65 ℃温育10 min。 5. 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5 min, 将上清转入一只新管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。 6. 沉淀用1 ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇． 真菌DNA的提取： （一） 1. 取真菌菌丝0.5 g, 在液氮中迅速研磨成粉 2. 加入4 mL提取液，快速振荡混匀 3. 加入等体积的4 mL的氯仿:异戊醇(24:1)，涡旋3～5 min（此处是粗提没有加酚，可以节约成本的哟！） 4. 1000 rpm，4 ℃，5 min 5. 上清用体积的氯仿:异戊醇(24:1)再抽提一次（10,000 rpm，4 ℃离心5 min） 6. 取上清，加入2/3倍体积的-20 ℃预冷异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀, 混匀, 静置约30 min 7. 用毛细玻棒挑出絮状沉淀, 用75%乙醇反复漂洗数次, 再用无水乙醇漂洗1次, 吹干，重悬于500 ul TE中 8. 加入1 ul RNaseA （10 mg/mL），37 ℃处理1 hr 9. 用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次（10,000 rpm，4 ℃离心5 min） 10. 取上清，1/10 V 3 M NaAc,2.5 V体积的无水乙醇, -70 ℃沉淀30 min以上 11. 沉淀用75%乙醇漂洗，风干, 溶于200 ulTE中，-20 ℃保存备用 DNA提取液：0.2 M Tris-HCl（pH 7.5），0.5 M NaCl，0.01 M EDTA，1％SDS，3 M NaAc （二） 1. 真菌菌丝0.5-1 g, 在液氮中迅速研磨成粉 2. 加入3 mL 65 ℃预热的DNA提取缓冲液，快速振荡混匀65 ℃水浴30 min, 期间混匀2-3次 3. 加入1 mL 5 M KAc，冰浴20 min 4. 等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次（10,000 rpm，4 ℃离心5 min） 5. 取上清，加入2/3倍体积的-20 ℃预冷异丙醇, 混匀, 静置约30 min 6. 用毛细玻棒挑出絮状沉淀, 用75%乙醇反复漂洗数次, 再用无水乙醇漂洗1次, 吹干，重悬于500 μL TE中 7. 加入1 ul RNaseA （10 mg/mL），37 ℃处理1 hr 8. 用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次（10,000 rpm，4 ℃离心5 min） 9. 取上清，1/10 V 3 M NaAc,2.5 V体积的无水乙醇, -70 ℃沉淀30 min以上 10. 沉淀用75%乙醇漂洗，风干, 溶于200 ul TE中，-20 ℃保存备用。 以上是我们常用的方法。