荧光偏振免疫分析（以环孢霉素检测为例）

基本原理

荧光偏振免疫分析（FPIA）是一种利用物质分子在溶液中旋转速度与分子量大小呈反比的特点，定量检测抗原或抗体的一种分析方法。

Ag或荧光标记的Ag（AgF ）旋转比Ag-Ab或AgF -Ab复合物快，当接受一个偏振光面的投入时，如AgF 分子的长轴与投入的偏振光面平行，荧光物吸收的偏振光最多，分子呈激发态，当回到基态时发射一个偏振光。

如果反应液中的分子发生旋转，发射的偏振光就会减弱，减弱的程度与分子旋转的速度呈正比，与分子大小成反比。

FPIA常利用竞争结合反应的原理，检测体液中的抗原或半抗原药物。在免疫反应检测系统中，标本中Ag浓度愈低，产生的AgF -Ab复合物愈多，偏振光愈强，反之亦然。

根据荧光偏振光强度与Ag浓度呈反比，以Ag浓度为横坐标，以荧光偏振光强度为纵坐标，绘制竞争结合抑制标准曲线。通过测定反应系统的偏振光强度，从标准曲线上就可确定地得知样品中待测Ag的相应含量。

FPIT与其他免疫荧光分析方法相比，具有以下优点：

①简便的均相测定方法，易于快速、自动化测定；

②血清样品可直接用于测定，样品用量少；

③精密度高，结果准确。

试剂及材料

1. 环孢霉素检测试剂盒，含以下主要试剂：

①环孢霉素标准物和荧光素（FITC）标记的环孢霉素；

②稀释液；

③除蛋白剂；

④环孢霉素mAb；

2. 荧光偏振免疫检测仪（TDX）

操作方法

1. 将各种试剂放置室温下，使其温度恢复至室温；

2. 将荧光偏振免疫检测仪接通电源后输入时间参数，放入稀释液，启动机器自动进行5次流动系统的清洗；

3. 取不同稀释度的标准品和待测样品（按一定稀释度稀释） 25ml，加入25ml表面活性剂和900ml稀释液，混匀震荡10s后，9500r/min离心3min；

4. 取上清，加入比色皿中，测定空白值；

5. 在上述管中，加入25ml抗体、25ml荧光素（FITC）标记的环孢霉素；

6. 保温3min后，测定最终偏振值。

结果分析

以不同稀释度的环孢霉素标准物为横坐标，以相应的荧光强度为纵坐标绘制标准曲线，从标准曲线上就可确定地得知样品中待测样品中环孢霉素的相应含量。