PCR反应体系的寡聚核苷酸引物
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一、引物设计的原则
1. 一般原则
(1)引物长度应在15~30 bp。其Tm=(G+C)×4+(A+T)×2,引物的有效长度Ln=2(G+C)+(A+T);Ln<38,因为>38时,最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度74℃,不能保证引物的特异性。
(2)引物中碱基的分布应当是随机的,避免一连串相同的碱基。3‘端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。
(3)G+C含量在40%~60%。
(4)两个引物在3’端绝对不能出现同源性,否则会形成二聚体。两引物之间不应有互补性,引物间连续的互补碱基必须少于4个。
2. 引物的3‘端引物的延伸是从3’端开始的,因此,引物3‘端的末位碱基在很大程度上影响TaqDNA聚合酶的延伸效率,不能进行任何修饰。
实验表明,不同碱基的引发效率在引物3’端末位碱基处有错配时,有很大的不同。同等条件下,引物3‘端第2位或3、4位的错配对扩增量影响不大,但易出现非特异扩增和引物二聚体。所以在设计引物时,应注意引物3’端尽量不用T,尤其应避免连续2个或2个以上的T。
3. 引物的5‘端引物的5’端对扩增特异性影响不大。因此可以被修饰而不影响扩增的特异性。如增加酶切位点、引入突变位点、标记生物素等。
4. 密码子的简并,如扩增3‘端区域,引物3’端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,影响扩增特异性与效率。
二、引物的浓度
为使PCR效率达到最高,必须保证反应混合物中有足够的引物和dNTP。一般PCR反应中,引物的终浓度为0.2~1 μmol/L。在此范围内,PCR产物的量基本相同;但引物低于0.2 μmol/ L时,产物量降低。
引物浓度过高则会促进非特异产物合成,还会增加引物二聚体的形成。非特异产物和引物二聚体又可作为PCR反应的底物,与靶序列竞争DNA聚合酶和dNTP底物,从而使靶序列的扩增量降低。