免疫组化双抗染色实验流程

一、脱蜡和水化

方法同SP法。

二、第一抗体的染色

1. 将切片浸在3%H2O2甲醇溶液(新鲜配制)中10 min，PBS冲洗3 min×3次;

2. 加100 ul(2滴)血清封闭溶液(试剂1)到切片上，室温孵育10 min，倒掉(不能冲洗);

3. 加入一抗(按照说明书推荐浓度和孵育条件);

4. 使用含有0.05%吐温20的PBS(TPBS)，冲洗5 min×3次;

5. 加入100 ul(2滴)生物素化的二抗(试剂2)，室温孵育10 min;

6. 用TPBS冲洗5 min×3次;

7. 加入100 ul(2滴)链霉亲和素-AP(试剂3)的二抗，室温孵育10 min;

8. 用TPBS冲洗5 min×3次;

9. 准备底物溶液：将1滴试剂4A和4B加入到1 ml去离子水中，充分混匀。再加入1滴试剂4C，充分混匀;

10. 加100 ul(2滴)配好的AP底物溶液，室温孵育(镜下掌握孵育时间);

11. 使用含有0.05%吐温20的去离子水冲洗终止反应。

三、第二抗体的染色

12. 加100 ul(2滴)双染增强剂(试剂7)，孵育;

13. 用TPBS冲洗3 min×3次;

14. 加100 ul(2滴)血清封闭溶液(试剂1)到切片上，室温孵育10 min，倒掉(不能冲洗);

15. 加入稀释好的一抗(按照说明推荐浓度和孵育条件);

16. 用TPBS冲洗5 min×3次;

17. 加入100 ul(2滴)生物素化的二抗(试剂2)，室温孵育10 min;

18. 用TPBS冲洗5 min×3次;

19. 加入100 ul(2滴)链霉亲和素-HRP(试剂5)的二抗，室温孵育10 min;

20. 用TPBS冲洗5 min×3次;

21. 准备底物溶液：将1滴试剂6A和6B加入到1 ml去离子水中，充分混匀。再加入1滴试剂6C，充分混匀;

22. 加100 ul(2滴)配好的HRP底物溶液，室温孵育(镜下掌握孵育时间);

23. 使用含有0.05%吐温20的去离子水冲洗终止反应;

24. 使用复染试剂染色(根据需要选择);

25. 封片剂(试剂8)封片，显微镜观察并拍照。