酶组织化学酶显示方法

1．偶联偶氮色素法 此法又称偶氮色素法(couplingazo dyemethod)，是指用某种人工合成底物在酶作用下产生分解产物，分解产物与重氮盐结合，引起偶联偶氮反应，形成不溶性偶氮色素，以此对酶定位。

常用的底物是萘酚系列化合物，如l―萘酚、2―萘酚、6―溴―2―萘酚、萘酚AS、萘酚AS衍生物等。由于重氮盐的种类不同，偶氮色素的颜色也不同，可显示出紫色、蓝色、红色、褐色、棕色和黑色等各种颜色。

重氮盐有不同程度的抑制酶活性作用，因此必须选择抑制作用最弱的种类使用。根据重氮盐抑制作用的有无和强弱，可将偶氮色素法分为两种：

(1)同时偶联法：是在底物混合液中，通过酶分解作用所得到的沉着物立即与重氮盐偶联形成偶氮色素。

(2)后偶联法：为防止重氮盐对酶的抑制作用，先使酶与底物发生作用，使分解产物沉着，然后再浸渍于重氮盐液中，使其形成偶氮色素。

偶联偶氮色素法具有作用时间较短、不容易发生酶丢失、正常组织细胞中无内源性底物和最终反应产物不易褪色等优点。但该法所用底物的分解产物有不同程度扩散，故定位欠准确，且人工合成底物价格较贵。

2．金属―金属盐法 一般是指金、银、铜、铁、铅和钴等金属，金属本身或其盐的化合物都具有颜色，容易发生呈色反应。而且酶的分解产物容易与金属结合。因此，捕捉酶反应的分解产物，使其与金属结合，利用呈色反应，再现酶反应部位，可以证明某种酶的存在。故称为金属―金属盐法或金属沉着法(metal precipitation method)，此法大致分三种：

(1)酶作用于底物时，其分解产物与底物混合液中某种物质结合，・沉着在作用部位，然后结合物被金属置换，通过金属显色来证明酶的存在。把上述反应过程归纳为三个阶段，即酶反应阶段、金属置换阶段和显色阶段。

(2)与第一种方法相比，省略了金属置换步骤。酶作用于底物后生成的分解产物与底物孵育液中的金属离子相结合，直接沉着于酶反应部位，使其显色。

(3)此法特点是使用人工底物(前两种方法使用天然底物)。在酶的作用下，人工底物的分解产物与特定金属结合，立即显色，或通过显色操作使其显色。此法包括硫代胆碱铜法和羟喹啉铁法。其优点是：底物、捕捉剂价格便宜；金属离子容易反应，沉着颗粒微细，反应色调鲜明。缺点是易褪色，组织细胞中有些成分可吸附金属离子，产生假阳性反应。

3．色素形成法 在酶作用下使无色化学物质在局部形成色素沉着。以下主要介绍三种类型：

(1)四唑盐法(tetrazolium method)：此法主要显示各种脱氢酶。在脱氢酶作用下，组织切片在含有四唑盐或双四唑盐的底物混合液中，使底物分离出的氢原子与五色四唑盐或双四唑盐结合形成红色或蓝色甲腊(formazane)或二甲腊(difomazane)色素。这种色素沉着于酶所在部位。

四唑盐法原理

(2)靛酚蓝法(indophenol blue method)：该法主要显示细胞色素氧化酶和过氧化物酶，是Na―di反应用于检测氧化酶的方法。把二甲基―对―苯二胺和a―萘酚加入底物混合液中，由酶作用而释放的氧与此两者结合，形成靛酚蓝而显示酶的部位。也可以用4―氨基―N、N―二甲基萘胺(AND)代替二甲基―对―苯二胺。

靛酚盐法原理

(3)靛蓝形成法(indigo formatlon method)：又称靛蓝法或吲哚酚法，在酶作用下，分解底物酯型吲哚酚化合物，产生出吲哚酚，在氧存在的情况下形成蓝色靛蓝，使酶存在部位显色。