细胞培养基本技术概述

无菌操作基本技术

1、实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。

每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。

2、无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。

3、小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45° 角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。

4、工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。

5、定期检测下列项目：

5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力。

5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。

5.3. 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。

6、水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。

培养基

1、液体培养基贮存于4 ℃ 冰箱，避免光照，实验进行前放在37℃水槽中温热。

2、液体培养基(加血清) 存放期为六个月，期间glutamine 可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量glutamine。

3、粉末培养基配制(以1 升为例)：

3.1. 细胞培养基通常须添加10 % 血清，因此粉末培养基之配制体积为900 ml，pH 为7.2 - 7.4。NaHCO3 为另外添加，若将NaHCO3 粉末直接加入液体培养基中会造成pH 之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3 粉末应分别溶解后才混合，然后用CO₂ 气体调整pH，而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH)，因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的pH 易发生改变。

3.2. 材料：

3.2.1. 纯水(milli-Q 水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要) 
　　3.2.2. 粉末培养基
　　3.2.3. NaHCO3 (Sigma S-4019)
　　3.2.4. 电磁搅拌器
　　3.2.5. 无菌血清瓶
　　3.2.6. 0.1 或0.2 mm无菌过滤膜
　　3.2.7. pH meter
　　3.2.8. 真空帮浦
　　3.2.9. CO2 气体

3.3. 步骤：

3.3.1. 取粉末培养基溶于700 ml milli-Q 水中，搅拌使其溶解。
　　3.3.2. 称取适量之NaHCO₃ 粉末(数量依培养基种类而异，表一)溶于200ml milli-Q 水中，搅拌使其溶解，然后通入CO₂ 气体至饱和，约3-5 分钟。
　　3.3.3. 将溶解且含饱和CO₂ 之NaHCO₃ 溶液加入溶解之液体培养基中混合。混后溶液之pH 应为7.2-7.4，除非pH 值偏差太大，否则不需用酸碱再调整之。若为太碱，可再通入CO₂ 气体调整pH。培养基以真空帮浦通过过滤膜时，pH 会升高0.1-0.2。
　　3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无菌容器中，标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于4 ℃。(血清亦可加入培养基中一起过滤) 。
　　3.3.5. 配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。

4. 配制培养基之生长测试

4.1. 材料：

4.1.1. MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004)
　　4.1.2. 6-well TC plate (or 35 mm TC dish)
　　4.1.3. methanol
　　4.1.4. glacial acetic acid
　　4.1.5. 10 % Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013)

4.2. 步骤：

4.2.1. 以待测试培养基培养MDCK cell，接种MDCK 细胞于6-well plate (或35mm TC dish) 中，每个well 接种1 ×102 活细胞，同时作对照组实验。 
　　4.2.2. 接种5～7 天后，在100 倍倒立显微镜作观察细胞群落之生长，待细胞群落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触时即可。
　　4.2.3. 去除培养基，加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇：冰醋酸﹦ 3:1)，室温下静置10 min。
　　4.2.4. 去除固定液，水洗二次。
　　4.2.5. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，，室温下静置染色2-3 min。
　　4.2.6. 去除染液，水洗二次。
　　4.2.7. 以肉眼计数群落数，并比较之，若新配制或新批号的培养基对细胞生长不佳，则丢弃之。

细胞传代培养

1、细胞生长至高密度时，即须分殖至新的培养瓶中，一般稀释比例为1:3 至1:6，依细胞种类而异。

2、材料：

2.1. 无菌磷酸生理缓冲液(Dulbecco’s phosphate-buffered saline, Ca⁺⁺/Mg⁺⁺ free, D-PBS, GibcoBRL 21600-010)

2.2. trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062)：以10 ml 分装于15 ml 无菌离心管中，保存于–20 ℃，使用前放在37 ℃ 水槽回温。

2.3. 新鲜培养基

2.4. 无菌吸管/离心管/培养瓶

3、 步骤：

3.1. 附着型胞(adherent cell)

3.1.1. 吸掉旧培养液。

3.1.2. 用D-PBS 洗涤细胞一至二次。

3.1.3. 加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm², 2ml/75cm²)，37 oC 作用数分钟，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉trypsin-EDTA 溶液。(若不移去trypsin-EDTA，则在trypsin-EDTA 作用后，加入适量含血清之新鲜培养基终止trypsin 作用，离心后再吸掉上清液。)

3.1.4. 轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入适量之新鲜培养基，以吸管上下吸放数次以打散细胞团块，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。

3.2. 悬浮型细胞(suspension cell)

3.2.1. 吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000 rpm 5 分钟。

3.2.2. 吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。

3.3. 融合瘤(hybridoma)

3.3.1. 有些hybridoma cell 需培养三天以上才会产生抗体，若是更换培养基，则可能会失去抗体。因此继代培养不需离心后更换培养基，直接添加新鲜培养基 稀释细胞浓度即可。若体积太大，可倾斜放置，或分殖至新培养瓶中。

收到细胞的处理方式

细胞活化

1、收到细胞株包裹时， 请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形， 若有请立即通知。细胞株请尽速开始培养， 或立即冷冻保存(置于–70℃，隔夜后，移到liq N₂)。

2、冷冻细胞解冻程序

2.1. 依据细胞株数据单指定之基础培养基种类、血清种类和其它指定之成份和比例， 制备培养基。绝大多数之细胞均无法立即适应不同之基础培养基或不同之血清种类， 若因实验需要， 必须有所不同时， 务必以缓慢比例渐次改变培养基组成， 确定细胞适应后， 方进行所需之实验。

2.2. FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清)和HS (horse serum, 马血清)，对细胞而言差异极大，请务必依据细胞株资料单指定之血清种类培养之。

2.3. 将培养基置于37 ℃水槽中回温， 回温后喷以70 % 酒精并擦拭之， 移入无菌操作台内。取出冷冻管， 立即放入37 ℃ 水槽中快速解冻， 水面高度不可接近或高过冷冻管之盖沿， 否则易发生污染。轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化后， 以70 % ethanol 擦拭冷冻管外部， 移入无菌操作台内。

2.4. 依据细胞种类和浓度，于无菌操作台内取10 ml 培养基加至T25 或T75 flask 中。取出已解冻之细胞悬浮液，缓缓加入T25 或T75 flask 内之培养基， 混合均匀，放入37 ℃，5 % CO₂ 培养箱培养。

2.5. 对绝大多数细胞而言，1 % 以下之冷冻保护剂DMSO，不会对细胞之贴附或活化有不良影响，不需立刻由解冻细胞中去除， 待第二天确定细胞生长或贴附良好后再去除即可。惟对极少数因对DMSO 敏感或会造成细胞分化之细胞，需 立即去除DMSO 者， 则可将解冻后之细胞悬浮液放入5 - 10 ml 培养基中，离心300 xg (约1000 rpm)，5 分钟，小心移去上清液，加入适量新鲜培养基，将细胞均匀混合后， 转移至培养瓶中， 再放入37 ℃， 5 % CO₂ 培养箱培养。

收到T25 flask 细胞时， 处理方式为

1、由于寄送过程中，为避免起泡造成细胞脱落死亡，T25 flask 均加满培养基。请检查flask 外观，并于显微镜下观察细胞生长状况和有无污染现象，若有任何问题， 不要打开盖子，请立即通知细胞实验室。

2、将原封之T25 flask 静置于37 ℃， 5 % CO₂ 培养箱中，使细胞回温至37 ℃， 并让运送过程中少数脱落的细胞可再附着生长。隔天后，于无菌操作箱内取出flask 内之培养基，(取出之培养基可以再使用)，仅留约5-10ml 培养基于flask 内，依一般培养方式再将细胞置入培养箱中，或细胞已长满盘， 则将细胞做传代培养。