关于人退变椎间盘细胞原代培养的一点体会

丁香园网友clellwei的观点为：

原代椎间盘细胞培养其实并不太难，但培养时间相对较长，所以容易出问题。

1、选材很关键

选用胎儿椎间盘进行原代培养相对容易一些，可利用反复传代的方法来制作退变模型。直接选择人退变椎间盘进行培养时（一般选择手术摘除的椎间盘），患者的年龄及间盘的退变情况必须充分考虑在内。

若年龄偏大，间盘退变很严重，培养的难度相应增大。20－50岁之间的患者都可采用。如果实验需要进行纤维环和髓核细胞的分别培养，在取回间盘时需仔细分离。

2、操作需仔细

原代培养的过程并不太复杂，从取回间盘冲洗开始到结束大约有6h左右的时间，其中的每一步都很重要。具体过程为:在无菌超净工作台上仔细分离纤维环和髓核组织，分别进行培养。

D-Hanks液冲洗3次至髓核组织中的血污全部洗净，用眼科剪把髓核剪成1mm3大小，置入离心管。

37℃以0.25%的胰蛋白酶消化20min，每5min摇动一次。800rpm低速离心5min，吸除上清液。37℃下以0.2%的胶原酶静置消化4h，至组织块逐渐消失。消化物用筛网过滤。

过滤后的液体以800rpm低速离心5min，弃去上清液；用Ham’s F-12培养液冲洗，800rpm低速离心5min，重复3次。用计数板进行细胞计数后接种于25cm2的培养瓶中，加入5ml含青霉素100U/ml、链霉素100U/ml和10％胎牛血清的HAMF-12细胞培养液。

37℃、5％的CO2培养箱中培养。每周换液2次，倒置显微镜下观察、拍照。26-28天髓核细胞达到80％融合时进行传代。需要注意的一点就是，F-12培养液的pH值控制在7.0-7.3之间。培养瓶放培养箱里面后需要旋开一点。

若在培养板内进行培养，则需要加盖后用封口膜把培养板周围缠几圈，这样会培养的顺利一些。

3、椎间盘细胞原代培养时24h后即可见到细胞贴壁，但数目极少。12天后细胞开始部分融合，细胞内分泌颗粒增多。15天后细胞增殖加快，分泌颗粒明显。25－28天左右达到80％融合时可以进行传代。

显微镜下观察细胞生长良好，可分辨出纤维样细胞，软骨样细胞，多为三角形、多角形或星形，胞体透明，折光性强，轮廓不清。

在胎儿培养时还能见到脊索细胞。传至4代或5代时细胞出现反分化，细胞体积明显增大，核深染，分泌颗粒减少，分裂相极少见。由此看来，整个过程相比较来说是比较长的。

4、其他的情况同一般细胞培养，注意无菌操作。