PCR产物纯化之试剂盒回收法

今儿我们来聊聊 PCR 产物纯化。PCR 产物一般都含有过量的引物、Taq DNA酶及dNTP，这些成分的存在将直接影响到后续的酶切、双脱氧PCR测序反应等过程，因此有必要除去。目前核酸纯化的方法有很多，商用化试剂盒的出现使得DNA的纯化过程变得更加简便快捷。

PCR 产物纯化回收试剂盒（SunShinecleanTM PCR Product Recovery kit）可简单、快速、有效的从PCR反应或其它各种酶促反应液中纯化 DNA 片段。根据回收片段大小不同，最高回收率可达到95%，有效的去除酶蛋白、DNA引物和dNTP等。

获得的DNA可用于克隆，标记，限制性酶切，体外转录/翻译等实验。

操作流程如下：

1. 取SunShinecleanTM DNA Mini Column 柱裝于2 ml 收集管上（已备）。加入500 μl Buffer B 平衡液至柱子內，室温下10,000 rpm 离心1 min，使平衡液完全流过柱子。弃去收集管中的平衡液，重新将DNA Mini Column柱装于该收集管上。

2. 将需要纯化的DNA（少于100 ul）置于干净的1.5 ml的EP管内，加入300-500 ul Buffer K，充分混匀。

（注：一些PCR产物可能含有石蜡油，石蜡油可能会导致回收率降低。因此我们建议将石蜡油尽量清除。）

3. 将混合液转移到第一步已经平衡的柱子里面，室温放置2 min，10,000 rpm离心1 min。

4. 弃去收集管中的滤液，将柱子装回2 ml收集管内，加入700 μl Buffer W（已用70%乙醇溶解的）至柱子中。室温下10,000 rpm离心1 min。

（注：浓缩的Buffer W在使用之前请用70%乙醇溶解。）

5. 重复步骤4一次。

6. 弃去收集管中的滤液，将柱子装回2 ml收集管内。室温下，12,000 rpm离心2 min以甩干柱子基质残余的液体。

（注：省去这一步将导致残留乙醇于DNA中。）

7. 把柱子装在一个干净的1.5 ml离心管上，加入10-50 μl（具体取决于预期的终产物浓度）Buffer E（可用超纯水或TE缓冲液代替）到柱基质的膜中央，室温放置0.5-1 min，12,000 rpm离心1 min以洗脱DNA。第一次洗脱可以洗出80%以上的结合DNA。如果再洗脱一次的话，可以把残余的DNA洗脱出来。

注意事项：

1. 若用水洗脱DNA，水的pH值应在8.0-8.5范围内，pH 值低于8.0会降低洗脱效率。

2. DNA需长期保存时，建议在Buffer E中保存。

3. 洗脱液提前在水浴锅中50-60 ?C预热，可提高DNA回收率。

4. 浓缩的Buffer W在使用之前请用70%乙醇溶解。

5. 建议使用新配的TAE Buffer作为电泳缓冲液。TBE Buffer或反复使用的TAE Buffer作为电泳缓冲液，都将影响DNA回收率。

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