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人肿瘤抗原的识别与鉴定---免疫沉淀

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一、裂解细胞

1. 收集细胞。将培养瓶置于冰上,倒掉培养基,用PBS 或生理盐水漂洗两 次,留适量液体于瓶内,然后用特制的细胞刮棒朝一个方向刮取细胞。 将细胞悬液转移到离心管,离心取沉淀,-80℃ 保存。 (收集细胞要迅速, 低温下进行,以减弱蛋白酶的作用)

2. 裂解细胞。采用 RIPA裂解体系,使用前 4℃ 预冷,按 107 个细胞加入 1.0ml 裂解液,吹打混匀,加入适量的蛋白酶抑制剂(如cocktail) ,冰上 放置 3~5 分钟。

3. 超声处理裂解液。 使用探针型超声进行多次适当频率的短促冲击,10~20 秒/ 次,重复 3 次,中间间隔 10~20 秒,冰浴下进行。

4. 15,000rpm,4℃ 离心 15min,吸取上清液于另一 Ep 管中,置冰上。上清液用于下一步的预处理。

二、裂解物的预处理

使用正常人的血清对裂解物进行预处理。

1. 按 1ml 裂解物加 2μl 对照血清的比例加入正常人血清。

2. 室温孵育 2~3 小时,缓慢摇动。

三、免疫复合物的纯化

1. 用 DynabeadsproteinA 进行免疫复合物的纯化。

2. 将 DynabeadsproteinA 振荡混匀,吸取 100μl 磁珠于 Ep 管中,置于磁铁架(Dynal MPC)上,磁珠吸附到管壁上,弃上清。

3. 加 500μl 0.1M Na-phosphate (pH 8.1 ) 至 Ep 管,轻柔搓动管子约 2~3min,将Ep 管置于磁铁架上,磁珠吸附到管壁上,弃上清。

4. 重复 2 步骤两次。

5. 清洗完磁珠后,加 500μl 预处理后的裂解物,反复摇动管子,室温下反应10~20min。

6. 将 Ep 管置于磁铁架上,磁珠吸附到管壁上,将上清转移至另一 Ep 管中。

7. 用 RIPA裂解液清洗磁珠 3 次。

8. 洗脱抗原- 抗体复合物。加 0.1M citrate (pH3.1)30μl于 Ep 管中,轻柔搓动管 子约 2~3min,将 Ep 管置于磁铁架上,吸取上清

9. 重复步骤 7,将上清收集于同一个 Ep 管洗脱样品总体积为 60μl ,作对照用。

10. 磁珠用 0.1M Na-phosphate (pH 8.1 ) 清洗三次后备用。

11. 在步骤 5 留取的上清中加入病人血清(1ml 加 2μl 血清) ,缓慢摇动,室温孵 育 2~3h。

12. 将 Ep 管置于磁铁架上,磁珠吸附到管壁上,弃上清。

13. 重复步骤 6~8。共收集到两份样品,对照与病人的纯化免疫复合物各 60μl 。

14. 磁珠用 0.1M Na-phosphate (pH 8.1 ) 清洗三次后加入柱储液 100μl,4℃ 保存。

15. 在样品中加入 2×SDS上样缓冲液并用 1MNaOH 调节 pH至使溴酚蓝呈蓝色。

四、1D SDS-PAGE

用免疫沉淀后的样品可直接进行一维凝胶电泳,或者对磁珠上的蛋白 A 或蛋白 G 进行耦联剂修饰,洗脱后的样品可进行 WesternBlot。

RIPA 裂解液: 150mmol/L NaCl;1.0%NP-40;0.5%脱氧胆酸钠; 0.1%SDS;50mmol/L Tris, (pH 8.0)。

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