接种病毒方法小结

1. 应该在细胞状态最好的时候，进行病毒接种或复苏；

2. 接种前头天，进行细胞传代，细胞数量应以能让细胞在第二天内达到覆盖满90%的培养瓶为准，并且一定要在细胞传代后48h内接种病毒；

3. 第二天细胞长为单层且状态较好时，开始接种病毒；

4. 先移弃培养瓶中的生长液，用undefinedPBS轻轻洗细胞面3次，最后用移液管吸干净培养瓶中残留的undefinedPBS。为保持培养瓶中pH环境的稳定，及减少undefinedPBS对细胞的刺激作用，可再用生长液轻轻洗细胞面1次移弃液体,并用移液管吸干净瓶中残留生长液;

5.接种病毒；

① 一般种毒量按最后所需加入维持液体积的10%，15%或20%来计算，一般10%即可，若希望病变速度快一些，可以加大种毒量，如15%或20%；

② 如果用小塑料瓶种毒。一般该培养瓶加8-9ml培养液，加入0.8ml病毒即可。病毒加入后，盖上瓶塞，轻轻将摇晃瓶子，让病毒液在细胞面上来回10几次；

③ 在对照细胞中，加入相同的0.8ml维持液；

6. 将种毒瓶和对照瓶一起放入37℃，CO2烘箱培养1h。其中每隔15min，需要将种毒瓶和对照瓶拿出，轻轻摇晃瓶子，保证病毒液或维持液能在细胞面上来回20-30次，使病毒液或维持液能充分接触细胞；

7.1h后，在晃动瓶子4次后，重新进入无菌间，在培养瓶中加入维持液；

① 维持液配方一

MEM 2鸖 3%谷氨酰胺 1%双抗 NaHCO3(其用量以调节pH至7.0为准,浓度为6%)；

② 维持液配方二

MEM 3%谷氨酰胺 1%双抗 NaHCO3(其用量以调节pH至7.0为准,浓度为6%)；

③ 一般还是使用有FBS的维持液，因为对细胞有一定的保护作用；

8. 将加完维持液的培养瓶放回37℃，CO2 烘箱培养，每天观察，如果有条件，可以每天拍照，直到有90%的细胞出现CPE后，可以进行收毒；

9. 收毒可以用反复冻融方法:即将细胞培养瓶放入-20℃冰箱，冻起来后，直接拿出来等起融化后，使劲摇晃瓶子，让细胞破裂释放出病毒颗粒，这样反复4次,即可达到收毒目的；

10. 收毒后的病毒液可以用移液管吸入离心管，在1,000-2,000转下离心10mins，以此除去细胞碎片，将离心后的上清夜转移，弃底部沉淀，该上清液即可用于病毒浓缩醇化，或病毒滴度测定,或中和试验等。