免疫组化标准操作规程(SOP）

一、试剂

1. PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L，Na 2 HPO 4 4.3 mmol/L， KH 2 PO 4 1.4 mmol/L。

2. 0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000 ml）：柠檬酸三钠 3 g，柠檬酸 0.4 g。

3. 0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700 ml水中溶解186.1 g EDTA·2H 2 O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000 ml。

4. 1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800 ml水中溶解121 gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000 ml。

5. 酶消化液：

a. 0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl 2 (pH7.8) 配制。
b. 0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。

6. 3%甲醇-H 2 O 2 溶液：用30%H 2 O 2 和80%甲醇溶液配制。

7. 封裱剂：

a. 甘油和0.5 mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0～9.5）等量混合；
b. 油和TBS(或PBS)配制。

8. TBS/PBS pH9.0～9.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.0～7.4适合于光学显微镜标本。

二、操作流程

1. 脱蜡和水化

脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60 ℃恒温箱中烘烤20分钟。

（1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；

（2）无水乙醇中浸泡5分钟；

（3）95%乙醇中浸泡5分钟；

（4）70%乙醇中浸泡5分钟；

2. 抗原修复

用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。

（1）抗原热修复

a. 高压热修复 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。

10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。

b. 煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95 ℃左右，放入组织芯片加热10~15分钟。

c. 微波热修复 在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。

适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。

(2）酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37 ℃，消化时间约为5~30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。