高分辨率荧光显微镜：突破科研的极限

在经历了一段时期测量技术的发展和近期物理学家带来的技术革新的冲击后，2008年，生物学家强有力的工具——高分辨率荧光显微镜问世了。Kelly Rae Chi报道。

2005年夏，细胞生物学家Jennifer Lippincott-Schwartz拆除了她在马里兰国立卫生研究院暗室的红灯。Lippincott-Schwartz 给两位赋闲在家的物理学家Eric Betzig 和 Harald Hess腾出房间。他们致力于研究光敏定位显微镜（PALM），一种他们希望可以显著提高荧光成像分辨率飞新技术，可用来观测纳米级生物。

Betzig， Hess和 Lippincott-Schwartz小组整个冬天工作在那间小屋，在那间无暖气的房间穿着棉衣，戴着帽子，收集数据。Hess说他和Betzig现在都在弗吉尼亚的霍华德休斯医学研究所的珍妮莉娅法姆研究校园，对生物学知之甚少。15年来，他们一直思考高分辨率成像。当他们知道Lippincott-Schwartz 和George Patterson 发现的光敏绿色荧光蛋白后，他们认为它正是他们探寻提高成像分辨率过程中的缺失环节。

“他们非常兴奋，”Lippincott-Schwartz回忆说，“我还记得第一次的影像，很难确定我们到底在看什么。”直到她在电子显微镜下看到荧光影像，Lippincott-Schwartz才相信这种方法成功了。“我想，‘这确实是正确的。’它太令人惊奇了。”

在过去的几年间，高分辨率荧光显微镜跨越了一大步，使得研究者可以从纳米级观测细胞突起的伸展。解释200—750纳米大小范围的模糊团块的时代结束了。虽然高分辨率显微镜这一设想上世纪80年代末在研究院提出并开展，最近几年才有技术上的突破，并伴随着商业化的启动。现在，很多实验室建起了他们自己的仪器并细调他们的样品，尤其是像 Lippincott-Schwartz这样的生物学家，最令人激动的时刻是看见它们能工作。

Stefan Hell冲破障碍

自从1873年，Ernst Abbe 首次提出衍射限制成像的规则，研究者们确信分析两个相邻的点的能力取决于波长的限制。一个多世纪过去后，Stefan Hell，现在德国马克思普朗克生物物理化学研究所的领导者，第一次从理论上和实验中被展示，可以使用光学显微镜来分析纳米级的物体，在衍射限制下。

作为上世纪80年代中期的毕业生，像他的指导教授一样工作于德国的海德堡大学，研究低温固态物理，Hell第一次意识到，不使用单镜头聚焦光线到一个点上而使用两个大孔径的镜头聚焦可能会提高分辨率。基于这一观点他发明了4Pi显微镜，他在自己家中工作，当他1990年完成博士论文时他的同伴去世了。“我思考，‘你怎样实现使用两个相对的镜头来提高分辨率这一想法呢？’”他回忆，“我设想着并把它写在纸上。”

Hell需要一个地方来展示这一理论。后来，他想到一个办法，他来到海德堡的欧洲分子生物学实验所（EMBL），他1991年开始工作的地方，由德国科学基金博士后支持。

早期，很多研究者，包括杰出的物理学家，认为Hell在提高分辨率方面不会走的太远。Hell

是在冒险，因为没有财政独立（支撑）。但他在尝试打破衍射障碍的想法。“我留在这里仅仅是因为我想提高空间分辨率，”他说。

Sunney Xie，现在马萨诸塞州哈佛大学剑桥学院的化学教授，在20世纪90年代遇见Hell并看到一些他早期关于高分辨率4Pi显微镜的言论。“他太有创意了，”Xie 说，“当他着手去做他相信的东西时，他一点都不惧怕挑战传统智慧。

Hell的冒险很值得。1992年，他第一次展示了4Pi显微镜比传统显微镜提高了3-7倍分辨率。但尽管它沿着z轴提高了分辨率，仍没有克服衍射限制规则。

在芬兰土尔库大学他的又一个博士后期间，一个星期六早晨当他躺在学生宿舍的床上看一本关于光的量子理论的书时，Hell有了一个想法。他想到，使用激光，他能荧光激活一个点，然后收缩那个点来消灭它周围圆环区域的散射。“我立即冲到实验室去验证，”他回忆到，“那是我经历的最激动的时刻。”

在土尔库，“Stefan 工作了很长时间，”他的长期同事Pekka Hänninen回忆，他第一次与Hell合作4Pi显微镜是他们都在EMBL时。Hell 说了很多他着迷的想法。Hänninen也记得较为轻松的时刻：小组工作到深夜时，Hell吹萨克斯的声音有时会穿过新建筑的走廊回响。

1994年，Hell在光学快报上发表了STED理论。但几年以后它才用于实践，这是Hell职业生涯中渐近而必要的步骤。在那期间，Hell花光了积蓄，为继续他的工作，卖掉了他的4Pi显微镜的专利权。

但Abbe的理论在当时仍然占据主流。很多物理学家拒绝Hell的理论并关注于其他成像方法。尽管如此，1997年，Hell 得到马科斯普朗克生物物理化学研究所一个五年合同来展示STED工作。1999年，他把终稿送至《自然》和《科学》。都拒绝了。“他们问我，‘你研究的是哪种新生物学？’他们没看出这可以改变显微镜，”他说。但在2000年，PNAS出版的数据中，STED被用来产生第一次真实的纳米级的荧光影像，而Hell 2002年在该研究所获得终身职位，继续研究和运用新的成像方法。

由于这些先驱的工作，大量的高分辨技术在学院的研究所被发展起来。现在珍妮莉娅法姆的物理学家兼工程师Mats Gustafsson领导的研究者们，研究了机构化照明显微镜，或者说SIM。这些技术背后的理论是用一连串的光图形照亮样品，这样可使不可见的超微结构以莫尔条纹的形式变成可见。这种条纹的信息可被计算机程序提取并产生高分辨的影像。2000年，在Hela 细胞肌动蛋白细胞骨架成像中，Gustafsson在横向分辨率方面进行了双重改进，与传统显微镜相比。他的小组后来利用非线性效应改进了分辨率到总因子4.

飞速发展

2006年，这一领域开启了新篇章，3个小组，包括Betzig 和 Lippincott-Schwartz，同时报告他们使用了另一种办法提高了分辨率。

Samuel Hess小组是三个其中之一。Hess，缅因州大学的物理学副教授，2005年夏与该大学化学和生物学工程师做了关于怎样才能提高分辨率以观察到肝细胞中的脂质筏的交谈。

此后，那个夏天的一个晚上，他被隔壁邻居聚会的声音吵醒了。半睡之中，他下楼并描绘了一个镜头和激光的可能方案的草图，该方案能使用可光敏的蛋白使细胞成像。“我想早上的时候我将对此大笑，”他回忆。但第二天早上，他无法找出这个想法的任何错误，因此他把带到了物理系同事那里，“他们也没发现问题，”他说。

因此Hess开始制作这个显微镜，虽然他的启动基金即将结束，需要时间和钱来使其运转。显微镜组装后，被实验室破裂的蒸汽管阻挠，Hess和他的同事急于收集数据，唯恐他们被超过。不到两天里，该大学表面科学与技术实验室的研究者就准备了一个蓝宝石晶体，使得他们可以证明成像工作。“他们做的如此迅速并超出他们的范围来帮助我们，这是难能可贵的，”Hess说。他的小组2006年在生物物理杂志发表了数据，称为荧光激活定位显微镜技术，简称FPALM。2007年，该小组证实FPALM可以用来检测脂质筏中聚集的蛋白。

与此同时，哈佛大学霍华德休斯医学院的研究员Xiaowei Zhuang的实验室，也研究高分辨成像。支持该方法的理论是所有三个小组的理论—利用单分子发射源成像的能力，编集成千上万个这样的影像来获得高分辨率—不可思议的简单。“我们一直疑惑是否其他人也这样想，”Zhuang说。

2004年初，Zhuang和她的同事偶然发现某种花青染料具有光控开关，也就是说，通过使用不同颜色的光，可以随意地把它们激活成荧光状态和失活成黑暗状态。从那以后，已经研究单分子成像多年的Zhuang，与两个学生开始研究这些光控探针，用它们来短暂地分离个体分子在空间上的重叠影像从而提高分辨率。相同的基本概念也很好地支持了Eric Betzig 和 Samuel Hess的研究，尽管他们依靠活化和永久脱色的光敏探针而不是依靠光控开关。

2006年Zhuang的小组在《自然方法》上发表了他们的想法，称他们的为随机光重建显微镜（STORM），并使用它以20纳米的分辨率观测DNA 和DNA蛋白质复合体。与此同时，Lippincott-Schwartz，Betzig， 和 Harald Hess在《科学》上发表了他们的PALM方法，使用它里给细胞黏着斑和特定细胞器的蛋白质成像。

投入实践

那些开始使用高分辨成像的生物学家的热情显而易见。劳伦斯伯克利国家实验室的生物物理学家Jan Liphardt记得第一次看到Betzig2006年在《科学》上的关于PALM的论文的情况。当他看到标记的线粒体蛋白质的影像，他立即想到怎样把它运用到自己关于微生物的研究中。

“通常我们荧光成像大肠杆菌，你大概得到20像素的信息，甚至可能更少，”Liphardt说。“现在突然这里能成像包括不止20像素，而是成千的像素。”

Liphardt 与 Betzig和其他人合作研究大肠杆菌的趋化性。“我真的完全无法想象有能力看见、计数和定位单个细胞中的各个蛋白质，”他说。“对我而言，我好奇很多事情精确地与哪些蛋白质在什么地方和什么时间有关系。有很多间接的办法来确定它们，但这可能是很长时间来我看到的最发人深思的技术革新。”

Nicholas Barry领导的一个小组也与Betzig的小组合作，丹佛科罗拉多大学的一个医学副教授，装备了一个商业化的蔡斯显微镜，专为全内反射荧光成像（TIRF）设计，研究蛋白质怎样聚集到肾细胞的顶膜。

Barry说有了蔡斯系统和平均计算机，其他部分的组装相对简单。他们增加了两个估价约3万美元的激光器。他们可以集成一个影像，使用大约10分子每帧，8分钟10，000帧。文件大小约三分之一gb。他们用一种免费程序语言—Perl 编写自己的软件。“在单分子literature有很多背景信息可用来辅助计算PALM图像，”他说。Barry 打赌很快会有人编写运行可插入成像的程序，来自国立卫生研究院的一种免费分析程序。“几乎可以肯定，”他说。

加利福尼亚帕罗阿尔托的斯坦福大学的化学与应用物理学教授W.E. Moerner，1989年第一次尝试看单分子光学，他说这些年来高分子成像经历了惊人的演变，现在通过使用单分子作为超高频发射器达到定点。“这个发展太棒了，在研究单分子几乎20年后，”他说。

2008及展望

自从2006年STORM和PALM问世以来，研究者兴奋地研究改进和新应用软件。2008年也不例外。Lippincott-Schwartz的小组把PALM和单粒子失踪结合起来探测肝细胞膜蛋白的运动。《科学》中，Zhuang的小组展示了3D STORM成像，比三维空间衍射极限空间分辨率好十倍，并使用此方法在猴肾细胞中成像微管和其他分子结构，后来扩展此方法为整个细胞的多色3D成像。Gustafsson和其他报告使用3D SIM—一种使用三束干扰光线代替二束的方法—来观测哺乳动物细胞核无法被共聚焦显微镜探测的部分。总部位于德国的蔡斯，进一步发展了SIM 和PALM 技术，期待2009年末公布彻底的成像系统。

Hell的小组，2008年初，使用STED方法视频展示活神经元里突触泡的活动，与标记抗体有关的蛋白质。后来，他们把4Pi和STED结合起来产生了固定细胞线粒体的3D影像，以40—50纳米的分辨率。进来，他们运用高分辨成像研究脑膜的形态学可塑性和重建活神经元树突的3D影像。

Gustafsson说，伴随3D和肝细胞的能力，过去几年该领域爆发了。“现在很明显，随着PALM和STORM等的出现，及近期的进展，这些技术使得过去不可能的很多事情成为可能，”他说。

虽然很多科学家从此技术中获益，仍有空间改进它的可及性。很多实验室能成功的运用此技术是由于研究人员精通物理学和生物学，他们能把显微镜组装起来并使它检测生物样品。Moerner指出编写软件不是一个小事，定位和报告你探测的光子需要仔细的计算来定义最终的分辨率。

高额的费用也限制了可及性。 Leica的TCS STED显微镜最高一百万美元，丹佛科罗拉多大学光学显微镜实验室的Bill Betz说，接受资助仍是一个挑战。Betz 为显微镜申请联邦基金但被拒了。“它新但昂贵。现在，管理者试图到处扩展资金，”他说，还说他们计划再申请基金。然而，Stefan Hell指出新激光设备使研究者在自己的实验室花费低于10万美元就组装一个STED仪器成为可能。

除了生物学家技术到手，研究人员说他们在目的在于更广阔的更多样化的范围的荧光探针。好的探针最终转变成好的分辨率和更快的图像处理。“为观察活的哺乳动物细胞，你必须有整套的光敏化和光控开关蛋白质，”纽约医学院阿尔伯特爱因斯坦学院的解剖和结构生物学的副教授Vladislav Verkhusha说，PALM促进了他自己在荧光蛋白的研究。

虽然研究这持续的改进，新的一年将标记着超分辨荧光显微镜方法广泛使用的开始，Harald Hess说。“它将真正进入生物学家手里，”他说。“与此同时，我们不断问他们，‘什么是实验的魔力杀手？’有很多好答案。”

Xiaowei Zhuang，她的小组在进行的很多方向之一是与Alice Ting和她在剑桥马萨诸塞技术学院的实验室合作研究允许小而亮的光控探针与细胞中的特定蛋白结合的标记策略，那样可使活细胞成像。“标记基因与小而亮的光控探针的结合将是未来分子水平高分辨成像的策略，”她说。