QIAgenes 预制蛋白表达载体

QIAgene Expression Kit——再也不为重组蛋白的表达效率发愁

据Protein Database的最新数据表明，目前已知的人类蛋白有35,000种(包括splice variants)，大约33%的蛋白正处于研究中，但是只有8%的蛋白能够成功表达。统计数据同时显示，目前克隆，表达，纯化的成功率只维持在54%，74%，59%。所以说，在蛋白表达的漫漫征途中，拿不到想要的蛋白是一件非常普遍的事情。举一个例子来说对于目标蛋白不表达或表达量低这个常见问题，需要排除或检查的因素就太多了。一般情况下我们要检查外源片断是否插到载体里面，检查是否引入了E.Coli不常用的密码子……而每个步骤的验证都要耗费宝贵的时间。

有没有办法提高表达的成功率呢？一般来说表达前的设计是非常重要的，比如预先对克隆片断的GC含量，密码子，mRNA二级结构等进行预测。网上的预测软件很多，但是究竟哪种优化策略或软件是最有效的呢？通常来说，DNA序列优化策略无外乎三种，一种是一个密码子一个密码子进行优化，但是这种策略通常会忽略mRNA二级结构影响。第二种策略是把所有的密码子一起进行优化，虽然听上去很全面，但是这种策略往往因为数据太多而达不到优化的目的。第三种叫做滑动窗口优化策略（Sliding window technology），它是几个密码子一起进行优化（保证优化的速度），同时进行滑动（确保不会落下任何有效信息）。

eneOptimizer™ Software采用的就是第三种策略，是目前市场上最好的优化平台，该平台由大名鼎鼎的GeneArt公司所开发。对于这个公司，这里要罗嗦几句，该公司在2006年就合成了5百万个碱基对，2007年又合成了6000个人类基因和变种。

至于QIAGENE公司，我想蛋白纯化领域的客户肯定不陌生，该公司拥有His标签蛋白纯化的金标准Ni-NTA的专利（也是因为专利在手，QIAGEN也为其他一些公司代工生产Ni-NTA）。值得一提的是QIAGEN最近几年在蛋白研究领域推出了一系列新产品，如天然蛋白制备和蛋白结晶产品线等。

这次QIAGEN和GeneArt强强联手，利用GeneArt的GeneOptimizer™ 平台以及QIAGEN在原核表达领域的经验，推出了QIAgene 预制表达载体（QIAgene Expression Kits—E.coli，专门针对35,000个人类基因所设计），专门用于解决E.coli中重组蛋白表达的瓶颈问题。

文章一开始就提到，在E.coli中表达真核蛋白的成功率很低，限制因素之一就是细菌和哺乳细胞的密码子使用频率不同；限制因素之二mRNA的二级结构导致翻译的低效率和蛋白的低产量；限制因素之三是信号肽的存在。而使用QIAgene E.coli预制表达载体则综合考虑了密码子使用频率的问题，同时消除了容易引起mRNA的二级结构的重复序列和其他因素。针对限制因素之三的信号肽因素，我们都知道在真核细胞中，糖基化蛋白和分泌性蛋白是通过越内质网膜紧密相连的核糖体合成的。这类蛋白质的合成与N端含有一个所谓的信号序列或信号肽，通常由13-36为主的疏水性残基所构成。要想在E.coli中有效表达这类蛋白，必须去掉信号肽序列。QIAgenes在实际操作中，将NCBI中所描述的信号肽序列从蛋白编码序列中删除。这反映在编码序列长度和和包含信号肽的基因的成熟序列的长度上有所不同。通过上述优化步骤，QIAgenes预制表达载体将克隆，表达以及纯化的成功机率提高至100%，90%，95%。

QIAgenes Expression Kits — E. coli

• 预制蛋白表达载体，专门针对35，000个人类基因所设计
• 合成全长、序列优化且经过验证的cDNA，cDNA免费克隆到表达载体，确保在E.coli体内体外系统高效表达蛋白
• 整套解决方案，提供QIAgenes Expression construct E.coli, Positive Control, Anti-His Antibody和Ni-NTA Spin column

表达载体结构

• 含有T7启动子，可直接在BL21（DE3）等菌株或利用无细胞系统进行表达
• N端带有6×His标签，在Ni-NTA上进行一步亲和纯化， 利用TAGZyme™可去除6×His标签
• 可表达无标签蛋白，利用Nde I酶切，再连接去除His标签
• C端内置琥珀终止密码子，可利用EasyXpress Site-Specific Biotin Kit进行生物素标记
• 卡那霉素抗性用于筛选 

图1 QIAgenes expression vector – E.coli

QIAgenes表达载体有效提高蛋白表达量

说了这么多，还是通过实验数据来具体看一下使用QIAgene前后蛋白的表达水平究竟如何吧！对表1中100种DNA序列优化前后的表达结果进行比较表明，使用QIAgene大于 90% 的蛋白被成功表达（膜蛋白占60%） ，产量比未经优化序列提高50倍。且无论在E.coli 体内，体外系统中均能得到最优表达（图2）：

对表1中100种DNA序列优化前后的表达结果进行比较，结果表明，使用QIAgenes大于 90% 的蛋白被成功表达（膜蛋白占60%） ，产量比未经优化序列提高50倍。且无论在E. coli 体内，体外系统中均能得到最优表达（图2）：

利用Ni-NTA纯化QIAgenes载体表达的蛋白

QIAgenes表达载体N端带有His标签，可以利用Ni-NTA一步纯化得到高纯度蛋白。如果实验需要得到无标签蛋白，His标签可以利用TAGZyme system去除（图3）。

 QIAgenes Expression Kits — Insect / Mammalia

• 预制蛋白表达载体，专门针对35，000个人类基因所设计
• 合成全长、序列优化且经过验证的cDNA，cDNA免费克隆到表达载体
• 带有三种启动子，可在哺乳动物细胞，昆虫细胞和真核体外表达系统中高效表达蛋白
• 整套解决方案，提供QIAgenes Expression construct Insect/Mammalian, Positive Control, Anti-His Antibody 和Ni-NTA Mag-Beads

表达载体结构

• 带有三种启动子，可在哺乳动物细胞，昆虫细胞和真核体外表达系统中高效表达蛋白
• C端带有10x His标签，不干扰N端信号序列，同时可获得更好的纯化效果
• 内置siRNA target site，可进行表达沉默（RNAi）研究
• 可用于RNAi恢复（rescue）实验，对siRNA效果进行验证

图4 QIAgenes expression vector – Insect / Mammalia

QIAgenes表达载体有效提高蛋白表达量

 

QIAgenes 表达载体订购

订购 QIAgenes Expression Kit可以直接获得优化和预制好的表达载体，省去了传统流程中的文库筛选，PCR扩增，亚克隆，克隆筛选，测序等繁琐步骤（见以下流程图）。

QIAgenes Expression Kit 的订购请点击www.qiagen.com/GeneGlobe/Default.aspx，选择所需基因，即可查询预制载体详情。 QIAgenes Expression Kit价格根据基因片段长度而有所不同。

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