检测单个转录本的新方法

在集合了多个细胞的群体分析中，稀有细胞中的分子有可能逃脱检测。而且，这些分析不能就检测到的分子究竟来自哪些细胞提供信息。单细胞中mRNA分子的表达可能与细胞群所检测到的平均表达差异极大。因此单细胞研究是研究表达的转录本中序列差异所必需的。荧光原位杂交（FISH）一直用于原位检测单个mRNA分子，但它无法分辨非常相似的序列，因此无法用于等位基因失活和剪接变体等研究。瑞典乌普萨拉大学的研究人员近日开发出一种新方法，来原位检测单个mRNA分子中的基因突变。这种方法能协助鉴定肿瘤细胞中的变异，目前已发表在Nature  Methods杂志上。

作为PCR和杂交方法的替代，锁式探针（padlock  probe）多年来一直用于分析核酸。这些高选择性的探针通过靶点依赖的连接转变成环状分子。随后用滚环扩增（RCA）原位扩增环化的锁式探针，提供单细胞水平上靶分子定位的信息。RNA分子也能作为锁式探针连接的模板，但RNA的原位检测要比DNA检测要困难得多。

乌普萨拉大学遗传学和病理学系的Mats  Nilsson等首先将mRNA转变成cDNA分子，再用锁式探针和RCA检测，从而实现了转录本的原位检测。根据研究人员的分析，这种方法能够鉴定出多个基因中的单个突变。这对混合了正常细胞和癌细胞的肿瘤分析来说特别重要。

研究人员相信这种方法对于多种疾病的诊断检测的开发，也是一个重大突破。研究人员能够在包含了多种类型的组织样本中研究基因变异体的影响。Nilsson等还打算进一步改善这种方法，以鉴定多个分子，并分析生物银行材料。

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Nature Methods (11 April 2010) | doi:10.1038/nmeth.1448

In situ detection and genotyping of individual mRNA molecules
Chatarina Larsson , Ida Grundberg , Ola S|[ouml]|derberg & Mats Nilsson

【Abstract】Increasing knowledge about the heterogeneity of mRNA expression within cell populations highlights the need to study transcripts at the level of single cells. We present a method for detection and genotyping of individual transcripts based on padlock probes and in situ target-primed rolling-circle amplification.