基本方案 ARMS 试验检测单个突变

基本方案 ARMS 试验检测单个突变

1.根据已介绍的 ARMS 引物指导栏，设计正常的、突变的和共同的 ARMS 引物以适合相应的突变。选择一个合适的参照引物，由此获得所有的引物并准备 50 umol/L 的各种溶液。

2.根据表9.7.2的指导方法准备正常和突变的 ARMS 反应体系，配40 ul预先混匀的反应体系至反应管中用于一个循环，如有必要可在室温放置几天或-20°C冻存几个月。

3.室温下加 5W已准备好的 10~50 ng/ul 对照DNA至每含有N和M混合引物的管中。

如有可能，分别建立含正常、杂合、纯合个体的 DNA作对照，包括一个没有加DNA 的含N和M管的空白对照。

4.加一滴石蜡油至每管中并盖紧，IOs高速离心。

5.加12.5ul 10XPCR反应缓冲液以稀释Taq DNA 聚合酶并加5 ul Taq DNA 聚合酶(5U/ul为最终浓度）至107.5 ul 无菌水中（足够10次检测），用移液枪混匀。

6.将PCR管放置热循环孔中，94°C孵育5 min后，以最短时间拿走并移至另一管中并加5 ul Taq DNA聚合酶，稀释至低浓度并覆有一层石蜡油，再放回94°C空白孔中。

重复此步骤，直至酶加入所有管中。

7.停止94°C程序并立即运行以下扩增程序：

35个循环：
1min 94°C(变性）

1min 60°C(退火）

1min 72°C(延伸）

1个循环

10min 72°C(延伸）

室温保存一周。

如使用PaKin-ElmerCetus9600进行快速热循环，其制造者要求改变循环次数以适合这类型机器的特点。

在扩增程序完成后，建议停止反应后应使孔中温度降至50°C以防止人为产物产生。

8.准备3% 琼脂糖胶使用4.5 g Nusieve’:agarose 3:1的比例，和1 X TBE含 0.5 ug/ul 乙啡啶溴化物缓冲液 150 ml(足够10次反应）。

9.标记一个0.5 ml微型离心管，另加10 ul 上样缓冲液至每管。

10.最好在无盖管在有蒸汽罩或隔离的实验室，以避免含有 ARMS 产物悬浮微粒，从石油油层下吸取25 ul ARMS 反应物至相对应的标记好的管中，并用移液枪混匀。

11.每个胶泳道点样20jul产物，包括DNA分子标记，电泳时间为1~2 h，电压120 V; 紫外线下照射成像。

12.按照引物（A和B、C和D或E和F)，分析每个泳道的预期大小及ARMS片段(对照片段大小分别应为360bp、813bp或825bp)。正常和突变的 ARMS产物有3个可能的结果：

所期待的结果。目的等位基因存在于样本中时，没有可见产物则目的等位基因缺失。

非特异性结果。ARMS有产物，目的等位基因存在于样本中；当目的等位基因缺失时，ARMS产物仍可见。

非敏感性结果。ARMS产物缺失或即使目的基因存在也很微弱；等位基因缺失时没有可看见的产物。

（1）如果从正常和突变的ARMS 引物中可获得期待的结果，那么优化条件已完成。ARMS 检测即可准备使用——省去第 13~14 步进行第15 步。

（2）如果有一个或两个ARMS引物是非特异性的，则进行第13a步。

（3）如果有一个或两个ARMS引物是非敏感的，则进行第13b步。

对于非特异性的ARMS引物

13a.增强反应特异性，用两套反应体系重复方案中第2步，分别用 2~5倍。

14a.如非特异性条带仍可观察到，在此末端碱基中增加错配的长度（表9.7.3)重复第1步。

对于非敏感性的ARMS引物

13b.用两套反应体系重复第2步增强敏感度，在两种反应混合物中分别用2~4倍 ARMS 引物数量或减少对照引物浓度。

14b.如所期待的ARMS产物条带仍然很弱或缺失，在此末端碱基中减少错配长度，根据表9.7.3重复第1步。

在特异和敏感的ARMS 反应中改变一条ARMS引物中额外的错配常引起一个大的改变，改变引物浓度有小的影响并可优化反应。

随后使用已知基因型DNA样本优化ARMS试验，要求先配制大批量的ARMS 反应体系，再分装，各自的ARMS反应体系能稳定保存在-20℃至少6个月。

15.实验操作中优化的反应条件中所获得的信息去分析DNA样本；样品来自第2~12步。如有可能，包括两个空白（无DNA)和对照（已知基因型）样本，如果发生问题，则参考表9.7.4。

备选方案 多种 ARMS 致多重突变的分析

常有必要分析一个特别的基因的几种不同突变点的存在或缺失，一个选择则将实施一系列单个ARMS检测；在这个流程中可选择的方法将再进行多重ARMS检测。

单个ARMS检测中大多数变量被标准化，并且引物序列和浓度改变以获得期望的结果这种方法同单个ARMS检测相同。原则的区别是有几对混合引物同时被优化，增加了程序的复杂性。从增加的复杂性看来，在多重ARMS检测的发展中不可能概括同水平的程序。在单一检测的发展上程序的基本步骤是一样的，但也有以下的不同。

1.一般，相较于单一的ARMS检测，在多重ARMS检测中使用不稳定的错配对较少，用表9.7.1(错配对的选择）及表9.7.3(错配长度）以选择较少的不稳定错配。

2.在反应中不同的ARMS产物是有基本大小差别的。最好设计ARMS产物大小有>50bp 的差别。在相同的实验中有必要使用一个 PCR 扩增较大片段产物的对照；在寡核苷酸链引物中列出可选择的两个程序（参见附录中对照引物配方）。

3.合并几种ARMS反应成两重反应体系。除去正常和突变的反应，则两个多重反应包含一些反应体系和其他突变的ARMS引物和正常 ARMS引物。

4.用于检测常染色体的隐性遗传疾病基因，如果同时分析至少四种突变并且两个反应管包含至少两个正常特异性的ARMS反应，则 PCR 对照反应能省去。

5.如果多重检测是在同样的外显子相邻位置的几个突变时，则有可能使用许多 ARMS引物中的单一的共同引物。

6.多重程序和单一的 ARMS 检测一样很重要，除了或许有必要重复全过程（第1~15步），因为同时要优化几个扩增的反应体系。

支持方案 口腔和血液样本中 DNA 的快速提取法

以下的步骤描述一种口腔和血液样本中 DNA的快速提取法以提供适合这个单元里描述的ARMS反应条件的 DNA。

舳提血液 DNA

1a.加 800 ul 现配的170 mmol/L 依酚氯铵至装有 200 ul 血液的 1.5 ml 离心管中，振动器上混匀 20 min，高速离心 2 min 以获得细胞团，除去上清液。

2b.用 300ul 的 10 mmol/L NaCl/lO mmol/L EDTA 洗细胞团，高速离心 15s。重复洗 3 次以除去可见的血红蛋白。

抽提口腔样本中 DNA

1b.在口腔中剧烈振荡 10 ml 4%（m/v) 蔗糖水 20 s 以产生含有上皮细胞的悬浮液。用 25 ml 无菌塑料样本管收集悬浮液。室温中 1200 g 离心 10 min 获得细胞。除去上清液。

为避免任何潜在的污染问题，要求收取上皮细胞悬浮液前 30 min 时，禁用食物和饮料。

2b.加500ul 10 mmol/L NaCl/lO mmol/L EDTA 再次悬浮细胞并移至离心管。高速离心 15s 并除去上清液。

3.用 500ul 的 50 mmol/L NaCl/lO mmol/L EDTA 重悬细胞团并旋转 Ios 以重悬白细胞团。无菌水孵育 20 min。

4.加 100 ul 的 1mol/L Tris·Cl 中和并旋转 5s。

5.高速离心 15s 除去细胞屑。-20℃ 保存上清液（5ul 包含约 100 ug DNA，足够一次 ARMS反应）直至使用时。