高通量、低成本SNP、突变或甲基化检测方法—HRM 技术应用

HRM 介绍

HRM 技术是high-resolution melting analysis 即高分辨熔解曲线分析技术，是近年国外兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。基于高效稳健的PCR 技术，HRM 不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR 结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP、甲基化、HLA 配型等的分析。

因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM 技术受到普遍关注。

HRM 原理

HRM 的主要原理是根据DNA 序列的长度，GC 含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度达到对单个碱基差异的区分。随着高精度PCR 仪（LightCycler® 480 和Rotor-Gene 6000 ）和饱和染料（LC Green 、Eva Green 等）的出现，HRM 技术的普及使用成为可能。

HRM 应用

 • SNP（单核苷酸多态性）的筛查。

 • 基因突变扫描，包括缺失、重复、点突变。

 • 新突变的筛查。

 • 甲基化的筛查。

 • 遗传育种中特定突变的筛查、未知突变的发现。

 • HLA 基因组配型、等位基因频率分析、物种鉴定、品种鉴定、甲基化研究。

 • 法医学鉴定、亲子鉴定。

 • 动植物品质相关多态性位点的研究等。植物抗逆性，突变与性状关联性研究。

HRM 特点

 • 高通量：1 次可同时检测10-384 样本，适合大样本、多SNP、多突变位点及多位点甲基化的扫描。

 • 高敏度：肿瘤研究中低突变率样品基因突变检测，最低检测到0.1%的突变样品基因突变，即检测到1000 个正常细胞中1 个突变细胞，适用于手术和其它微量组织中突变检测。检测灵敏性远高于“PCR+ 测序”的25% ，即100 个正常细胞中至少有25 个突变细胞，测序仅适用手术组织。

 • 特异性好：PCR 产物无需后续处理，特异性高达100% 。直接未知杂合突变鉴定准确性100%，特异性100% 。直接未知纯合突变鉴定准确性96%， 利用非标记探针快速基因分型法直接未知纯合子鉴定准确性100%。

 • 重复性好：重复性100% 

 • 使用范围广：不受碱基位点局限，除可检出已知突变外，也能检测出未知突变。

 • 重复性好：样品PCR 和HRM 分析直接在同一管内进行，实现闭管操作，避免交叉污染。

 • 操作简便：只需设计特异引物，无需序列特异性探针，无需测序，也不受突变碱基位点与类型的局限。

 • 成本低：简化操作时间和步骤，大大降低成本，检测费用远少于测序、Taqman 探针技术。

 • 标本范围广：可用于新鲜或酒精固定、石蜡包埋的手术标本，也可用于微量的穿刺或活检标本、血液标本、粪便标本等非手术标本的检测。传统“PCR+ 测序”方法难以检测大部分不能手术的患者。

 • 其它：只检测PCR 样品中荧光强度的变化，不消耗任何PCR 样品，无污染，PCR 产物可以进行下游分析，非常适合于测序前的SNP、甲基化等预扫描筛查。

HRM 应用举例

• SNP 检测

单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs ），指单个核苷酸碱基的改变，包括置换、颠换、缺失和插入，导致的核酸序列的多态性。在不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷酸序列一致而只有一个碱基不同的现象，这就是SNP。SNP 在人类基因组中数量较多，发生频率较高，因此被认为是继微卫星之后的新一代遗传学标记。

HRM 检测SNP 技术是依据在一定的温度范围内将PCR 扩增的产物进行变性，期间实时检测体系内荧光信号。荧光值随着温度变化，可绘制溶解曲线。每一段DNA 都有其独特的序列，因而也就有了独特的熔解曲线形状，如同DNA 指纹图谱一样，具有很高的特异性、稳定性和重复性。根据曲线准确区分野生型纯合子、杂合子和突变性纯合子（下图）。
 

检测SNP 的方法有很多种。成本较低、通量较大的方法大都局限于已知、特定位点，如Taqman 探针法。既要对已知位点分析又要查找未知位点，一般采用PCR+ 测序的方法，成本高、操作繁复较低。

HRM 技术是一种低成本、高通量、快速，且不受位点局限的检测方法，是SNP 筛查的最佳选择。

SNP 检测方法比较

研究方法	优点	缺点
直接测序法	SNP分析的金标准能发现已知和未知SNP 位点	每个位点均需要经PCR 扩增，然后测序，成本较高，工作量大，周期特别长，价格昂贵，不适合大样本做疾病关联分析，且容易交叉污染。
Taqman探针法	适合已知SNP 位点、位点数量少、通量高的检测	价格昂贵（探针合成费用高），不能同时发现未知SNP 位点
非探针普通PCR 方法	技术简便，价格便宜，仅适用已知SNP 判断，不能确定何种SNP，适宜少量样本的实验室检测	费时费力，速度较慢，灵敏度差；RFLP 仅能检测有酶切位点的SNP，无酶切位点不能检测；上述方法都需要凝胶电泳，DNA 链二级结构容易造成人工假相使结果出现偏差。SSCP、DGGE 花费时间长、稳定性差、灵敏度有限，难以大规模开展工作。
芯片技术	与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化、防污染等特点	仅适用于全基因组SNP 扫描，不适宜单个基因的SNP 位点检测，精度低，价格昂贵。
I umina技术	这种方案可以帮助研究人员在得益于起始样品量要求很低优点的同时，还能够检测多个感兴趣的区域，从而检出罕见的基因突变。	高通量SNP 检测用于SNP 在全基因组上的扫描分析，价格昂贵。
MALDI-TOFM S质谱技术	检测速度快，所需样本量极少。理论上能分开单个碱基变化	这种纯物理检测易受到样本因素的多种干扰，精确度难以保证。这种方法适宜于已经优化的特定SNP 检测，不适宜该服务商未做过或很少做过的新SNP 检测。检测过程需要多点质控，否则精确度很低。另外，很重要的一点是这个检测PCR 过程和质谱过程是分开的，PCR 需要自己做，并不便宜。
基于罗氏LightCyclerTM 480HRM 技术	高通量、简单、快速、低成本、高灵敏度。闭管检测，避免假阳性；检测已知和未知SNP； 灵敏度和精确度达近1 %；HRM分析和PCR是同时进行无需另外仪器相比MS等减少了额外仪器，成本更低、特异性和精确度更好。	须用罗氏LightCyclerTM 480 PCR 仪， 或LightScannerTM 等仪器，专业技术要求高，需要专业人员操作。

    

苏州为真生物医药科技有限公司在SNP 位点分析和研究方面积累了丰富的经验，拥有开展SNP 研究的先进仪器设备，具有自己独到的研究策略和方法，能有效挖掘资源，为你提供高效快速的SNP 分型服务。

• 甲基化检测

DNA甲基化是DNA碱基序列CpG岛上常发生的一种共价修饰，使基因表达受抑制，可以遗传。在肿瘤等病理组织中，特异基因的特征性甲基化状态可以作为早期诊断的重要标志物。甲基化检测包括特异性PCR、Northern印迹法、芯片等，测序是“金标准”，但这些方法低通量、成本高、花费大量时间且难以标准化。

高分辨率熔解（High ResolutionMelt,HRM）是一种最新的在表观遗传学中检测CpG 位点的一种新技术，可区别单个碱基的甲基化差异（下图）。

HRM检测甲基化的方法具有高通量、操作简单、灵敏高、重复性高、成本低、不受检测位点的局限高度等优势，将对于遗传学、肿瘤学等方面的研究和临床应用提供更大的帮助。

苏州为真生物科技有限公司在HRM 分析和研究甲基化方面已经积累了丰富的经验，建立了完善的技术路线，拥有开展HRM 研究的先进仪器设备，具有自己独到的研究策略和方法。本公司可为你高效快速的进行HRM 分析甲基化位点，找出有意义的CpG 甲基化位点。

• 突变筛查

HRM 的特点是高特异性和高灵敏度，检测灵敏度可以达到1%-0.1% 。在大量样本、多个突变位点的筛查上，比传统的非均一性方法（如dHPLC）更方便、性价比更高，因为后者需要将扩增产物转移到另一台仪器上进行突变分析。

HRM 可对任何扩增子上的未知突变进行筛查，不需要识别不同等位形式的引物或探针，不受突变碱基位点和种类的局限，既可以对未知突变进行筛查、扫描，又可以对已知突变进行分析。所以，相比定量探针法的突变分析和其它类型的快速突变分析法，应用面大大拓展，成本也大大降低，成为近年来国外新兴的遗传学、方法学研究和应用热点。

苏州为真生物科技有限公司在HRM 分析和研究各种突变，包括缺失、插入、碱基变化等方面积累了丰富的经验，拥有开展HRM 技术的先进仪器设备，具有自己独到的研究策略和方法，能为你高效快速的进行突变筛查分析，找出与疾病密切相关的突变位点。

• 其它应用

植物和动物品质和育种中基因型鉴定：HRM 方法快速而有效的解决如何确定亲本的基因型是否相同、有否新型性状的遗传突变等问题。

HLA 基因组配型：器官移植的HLA 配型、同胞之间HLA 基因型确定，应用举例：快速确定HLA 高度多态性位点的类型，及非亲源关系个体间异源造血干细胞移植前的HLA 基因型确认。

等位基因频率分析：SNP 频率分析等。

物种鉴定、品种鉴定：微生物品种、物种快速鉴定；动植物品种鉴定。应用举例：临床细菌的鉴定。对临床细菌的培养物进行16SrRNA 的实时扩增，并进行HRM 分析，每个菌种的熔解曲线模式就如果该物种的分子指纹，从而可以根据HRM 的不同对细菌进行鉴定。

法医学鉴定、亲子鉴定：检测单核苷酸多态性SNP 鉴定，插入/缺失多态性DIP 鉴定等。应用举例：将HRM 用于法医学SNP、DIP 鉴定，协助犯罪鉴定，亲子鉴定。相对于传统鉴定方法，HRM 是一种简单、便宜、高通量的二等位基因分子标记鉴定的方法。

HRM 技术的国内唯一服务提供商——苏州为真公司

苏州为真生物医药有限公司（Suzhou Microdiag Biomedicine Tech. co.,Ltd.），网址：www.microdiag.com 。

本公司致力于科研和诊断用的国际最新型分子技术HRM 的国内推广应用。随着高精度PCR 仪（LightCycler® 480 和Rotor-Gene 6000 ）和饱和染料（LC Green 、Eva Green 等）的出现，HRM 技术的普及使用成为可能。

依据2007 年国际新开发的qPCR-HRM （高分辨率溶解曲线分析技术）技术，我们技术服务部的员工通过不懈努力和实验优化，建立成熟的高标准、高通量的SNP、突变和甲基化的检测平台，是国内唯一提供此项高端技术的服务商。

• 我公司在HRM 技术方面的优势：错误！未找到引用源。摸索出最佳的实验方案、反应条件以及反应体系，建立了完整的质量考核和控制体系，达到标准化的检测流程，保证结果可靠真实。错误！未找到引用源。我公司具有目前唯一一个可提供完整的HRM 基因扫描解决方案公司。现已经与多家学校和医院包括中国协和、苏州大学第一医院、浙江大学、浙江人民医院等多家客户，使用HRM 技术检测甲基化、突变以及SNP 分型。错误！未找到引用源。拥有Roche 的高通量模块式定量PCR 系统——Roche LightCycler® 480 和高灵敏度的DNA 定量仪Nano 1000 ，为高灵敏的HRM 技术服务提供了关键仪器保障。

国内类似服务公司还有几家，但技术上根本达不到要求。苏州为真公司是唯一把HRM 技术做到标准化、常规化的国内服务商，在HRM 技术服务领域处于遥遥领先的地位。

 • 样品处理：

 • 组织标本：取新鲜组织块50mg ，一种用液氮或干冰保存、运输，另外可放入装有含RNAlater 冻存管（本公司提供），4℃低温保存并常规冰袋运输。

 • 穿刺或者活检标本：处理方式同上。

 • 酒精固定标本：对于不能送检新鲜标本的送检者，请将标本从手术台上取下后，立即切取肿瘤标本（≥5mm3），放于容器内（如带盖的塑料瓶），采用75％的乙醇立刻固定，保证酒精的体积是标本的5 倍左右。

 • 石蜡包埋组织切片：要求提供10 张组织切片（面积>10 mm×10 mm ，厚度约5 －10μm），载玻片片盒保存、常温运输。如果组织太小，请酌情增加送检样品数量。

 • 血液样本：取5ml 抗凝血，获得血浆，常规冰袋4℃低温运输。

 • 胸腹水：肿瘤胸腹水离心后加75% 的酒精1 ml 。

 • 粪便：收集10g 粪便，用柱式离心的方法收集基因组DNA。

 • 服务流程：

 

 • 检测流程：