京天成46天制备高质量单克隆抗体《创新技巧》

如今，单克隆抗体市场炙手可热。一方面，由于巨大的应用价值，单克隆抗体需求强劲。另一方面，单克隆抗体制备工艺复杂、周期长。为此，能否快速制备出高质量的单克隆抗体已成为影响抗体研究应用的关键。46天制备出高质量的单克隆抗体在几年前在京天成生物技术（北京）有限公司得以实现，从而使之在全球制备高质量单克隆抗体服务竞争中占极大优势。

单克隆抗体具有理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、便于人为处理和质量控制等特点。正是这些优点使它一问世就受到高度重视，并广泛应用于生物学和医学研究领域，如临床诊断、临床治疗、蛋白质分离纯化等。而单克隆抗体药物的诞生更是引发了生物制药产业的革命。现在，单克隆抗体药物已成为生物制药业的“重磅炸弹”。但与此同时，单克隆抗体制备的缺点也是显而易见的：1.制备周期长。现在常规的单克隆抗体制备方法一般需要4到6个月。2.制备技术复杂。单克隆抗体无法采用生物化学的方法从多抗中分离，而只能采用细胞杂交的方法来制备，其中涉及多种生物学技术。3.制备成本高。另外，能否筛选到理想的单克隆抗体既有技术问题也有机遇问题，因此，制备单克隆抗体的风险也就不言而喻。

如今，单克隆抗体市场炙手可热。一方面，由于巨大的应用价值，单克隆抗体需求强劲。另一方面，单克隆抗体制备工艺复杂、周期长。为此，能否快速制备出高质量的单克隆抗体已成为影响抗体研究应用的关键。46天内制备出高质量的单克隆抗体在几年前在京天成生物技术（北京）有限公司（同上）得以实现，从而使之在全球制备高质量单克隆抗体服务竞争中占极大优势。

京天成是怎么做到这一点的呢？因为，京天成具有独特的技术优势、管理优势和重视设计这三大法宝。京天成将 “质量是设计出来的，而不是检测出来的” 这一精神贯彻到实际工作中。而这一精神正是新药研发公认的准则。京天成正是靠着整体和每一个环节的精确设计加上技术优势和管理优势实现客户的满意和公司的发展。

1. 设计理念和技术优势

a、独自开发的软件辅助免疫原设计

免疫原可以是全长的蛋白、重组蛋白的一段，与载体蛋白偶联的合成多肽或小分子化合物，而产生的抗体则是期望能够检测到样品中天然的蛋白或小分子抗原。如何用和抗原不尽相同的免疫原诱导出能够识别抗原的抗体，很大程度取决于免疫原的设计。京天成凭借团队过去20多年的抗体研发经验，结合生物信息学，建立起了一整套免疫原设计的规范和程序。

由于现在新蛋白的抗体的研发工作大多依赖人工合成多肽或重组蛋白。选择哪一段基因来合成多肽或蛋白，这就是我们首先必须回答的一个问题。人们一般期望得到特异性强的抗体，并希望抗体有中和效果。我们一般通过计算机去寻找和已经所有蛋白同源性最小的肽段作为免疫原的一部分。一般情况下，我们通常选择10～18个氨基酸的多肽作为半抗原。而选择哪10～18个氨基酸，根据氨基酸的亲水性、免疫原性和多肽旋转角度等参数我们设计出一套保密的计算机软件，并利用它为顾客提供免费的设计。

b、多肽或小分子和载体蛋白的化学偶联方法

在合成多肽时，我们通常在多肽的某一端多加一个半胱胺酸，利用其上面的巯基和已经预先巯基化的载体蛋白相连，这样的连接只会产生一个偶联产物，把我们希望产生抗体的一端暴露在外侧，免疫后得到的抗体成功率也明显提高。

c、载体蛋白的选择

我们根据偶联上的多肽的免疫原性差异，分别采用Limpets的KLH、BSA、OVA等作为载体蛋白，从而保证抗体的特异性和灵敏度。

d、独特的免疫佐剂

免疫佐剂对免疫周期的影响及常用的免疫方法如下：

第0天 抗原与弗氏完全佐剂混合，肌肉和皮下注射多点。

第10天 第一次加强注射，用抗原与弗氏不完全佐剂混合进行肌肉和皮下多点注射。

第20天 第二次加强注射，抗原与弗氏不完全佐剂混合；

第30天 第三次加强注射，抗原与弗氏不完全佐剂混合；

第40天 尾静脉采集血清，ELISA检测；

第50天 第四次加强注射，抗原与弗氏不完全佐剂混合；

第60天 尾静脉采集血清，ELISA检测；

第61天 取小鼠脾细胞进行融和。

京天成优化的免疫方法：

为了缩短免疫时间，京天成使用了保密配方的佐剂，将其用于小鼠的免疫。

第0天 抗原与保密配方佐剂混合，肌肉和皮下注射多点。

第5天 第二次加强注射；

第14天 尾静脉采集血清，ELISA检测；

一般情况下，我们在第14天即可观察到较强的免疫反应，随即进行融合。

e、杂交瘤细胞的克隆

常用的克隆方法为：取小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融和，3天后将细胞分配到10块96孔板继续培养14天后， 取细胞上清液，通过ELISA检测。 阳性孔内的细胞，按倍比稀释进行亚克隆。通常需要3～6个月时间才能完成整个亚克隆的过程。在亚克隆的过程中，常常原来呈阳性的多克隆细胞，失去了信号。

京天成研发出一种特殊的培养基，含有非常丰富的B细胞生长所需的细胞因子。我们直接用单个细胞培养，省去了亚克隆的整个步骤。通常在融合后的第12天通过ELISA即可知道是否得到针对抗原的单克隆抗体，时间上大大缩短。每块96孔板里，我们不仅得到多株阳性克隆，而且其中不少是抗原特异性的单抗。

第16天，我们搜集初筛阳性克隆的上清液，在重复前面的ELISA的同时，也对抗体的灵敏度进行初步的评价。

第20天，将细胞上清液送到顾客实验室，供顾客进一步验证。有的顾客需要的是能够Western Blot的抗体。因为我们的单抗研发流程包含有多处保密技术，故不能在此详细描述。

加上前面免疫的3～4周时间，平均在60天内即可给顾客寄去分泌顾客期望的单抗的杂交瘤细胞。目前，京天成单克隆抗体制备成功率能够已达到85％以上。

2、单克隆抗体－抗生素免疫交联物研发平台

一些用于治疗晚期癌症的特异性单抗已经上市。但是这些单抗它本身的药效有限，必须和其它化学药一起使用。而且它的剂量很大，每年每个病人需要1g。目前只有很少几个发达国家拥有大规模生产药用单抗的能力（1万升反应罐），已经供不应求。而中国目前最大的反应罐才几百升，这是国内发展单抗药面临的一个严峻问题。由于单抗的生产成本很高，且剂量大，每个病人每年的费用在30万人民币以上，是绝大多数中国病人无法承受的开支。解决这一问题的最佳办法就是让病人服用单克隆抗体-抗生素免疫交联物。偶联化疗药后并没有对抗体的亲和力产生明显的影响，但却显著提高了抗体对肿瘤细胞的杀伤力。本产品的副作用与一般的化疗相比，毒性会大大的降低，并且因为联上抗生素，单克隆抗体－抗生素免疫交联物杀肿瘤的能力又比单抗本身提高了近百倍，可以显著地降低单抗的剂量。京天成引进并完善了一套已经申请了国际专利保护的单克隆抗体－抗生素免疫交联物的研发技术平台。该平台能极大地提高单克隆抗体药物的研发效率，这给几十万普通的中国癌症病人带来新的希望。

3、管理优势

公司拥有ISO9001-2008质量管理体系资质，同时应用符合21 CFR part 11规范的实验室信息系统管理软件和符合国际规范的标准操作程序，为客户提供准确、及时的实验结果报告。2009年，京天成正式成为“高新技术企业”。现在，京天成已经建立抗体技术服务的标准操作程序和实验室信息管理系统，提供专业的“一站式”抗体研发服务。

4、成果和目标

在短短几年时间里，京天成人的努力已经结出累累硕果。自2007年至今，京天成先后申请、承担和完成了北京科技计划项目6项，申请专利4项，发表SCI文章9篇。2009年，京天成成功研发出全球首例具有中和活性的EV71单克隆抗体、狂犬病毒快速检测试剂、磺胺药物残留检测试剂盒和试纸条等众多产品，并获得使用单位和政府好评。

京天成人愿与大家分享我们的经验和优势，提高我们的效率、节省我们的时间和资源，一起获得成绩和取得进步。京天成人也一定会用更好的服务和产品来回报社会。作为中国生物技术创新服务联盟（ABO联盟）的一员，京天成人将与大家一起继续为中国的生物技术创新做出应有的贡献。

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