新免疫沉淀实验工具介绍

和光纯药工业株式会社 基因研究所 西部隆宏、吉居华子

前言

免疫沉淀法，是利用固相化在磁珠上的抗体与抗原（目的蛋白质）发生沉淀反应原理使蛋白分离、纯化。此方法不仅用于抗原蛋白质的纯化，还可以与抗原蛋白质相互作用，令蛋白质、核酸共沉淀，可应用于蛋白质间的相互作用、染色质免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation: ChIP）、RNA免疫沉淀（RNA Immunoprecipitation: RIP）等实验里，在蛋白质组学、表观遗传学、非编码RNA等研究领域有广泛的应用。本文介绍和光纯药的科研人员研发的新型免疫沉淀方法，使用这个方法可简易制作适用于免疫沉淀法的抗体固相化磁珠。

此方法的特点

首选，我们介绍一下这个方法的优点。免疫沉淀法里使用的磁珠，一般使用多孔琼脂糖、琼脂糖凝胶或者磁性材料等，本方法使用的是在二氧化硅表面涂有特殊聚合物、非特异性吸附低的新型磁珠。粒子径1-8μm大小，比琼脂糖、琼脂糖凝胶密度更高，离心分离后磁珠会牢牢吸附在管底，去除上清液后可进行清洗。另外固相化到抗体的磁珠上的方法一般有以Protein A、Protein B等介入的亲和性结合固相化方法，和用磁珠表面的官能团和抗体的氨基进行偶联化学结合的固相化方法，本实验里采用化学结合固相化法。磁珠表面的PNP基（p-nitrophenyloxycarbonyl）和抗体的氨基反应，从而使磁珠固相化抗体（图1）。化学结合固相化法与亲和性结合固相化方法相比，虽然操作步骤更多、更费时，但具有固相化后的抗体难以剥离，且不易受抗体的动物物种、亚种影响，抗体外的蛋白质也可固相化等优点。

图1、磁珠表面PNP（p-nitrophenyloxycarbonyl）基和氨基的反应

在RNA免疫沉淀法里的应用

其次，我们介绍一下在RNA免疫沉淀法里应用本方法制作的抗体固相化磁珠的例子。在二氧化硅磁珠里使用了固相化抗Argonaute抗体的磁珠，通过RNA免疫沉淀法可得到结合到Argonaute蛋白质里的microRNA。实验中固相化了抗人Ago2抗体磁珠的人Ago2，从人细胞株的细胞裂解液中纯化结合在Ago2里的microRNA。结果可从各种人细胞株里得到高纯度的microRNA（图2）。

图2、抗体固相化磁珠在RNA免疫沉淀法里的应用

RNA免疫沉淀试剂人Ago2里，使用本方法的二氧化硅磁珠里的固相化了抗Argonaute抗体的磁珠，从3种人培养细胞株（HeLa、HepG2、HEK293）及小鼠培养细胞株（P388D1）中纯化结合到Ago2的microRNA。纯化样品进行UREA-PAGE后，根据银染的结果，从人培养细胞株中高纯度纯化结合到Ago2的约22个碱基的microRNA（因为抗体不反应因此不能纯化小鼠细胞株）。使用的细胞数大约为5 X 10⁶ cells

固相化抗体外的蛋白质

最后再介绍一个固相化抗体外的蛋白质的磁珠的例子。用磁珠固相化Protein G，并计算用了这个磁珠的溶液中的抗体回收率。然后发现结果取决于Protein G固相化磁珠的量，显示可以回收溶液中的小鼠IgG（图3）。

图3、固相化抗体外的蛋白质

使用本方法把Protein G蛋白质固相化到磁珠上（Protein G固相化量20μg/mg beads），再用0.5-4mg该磁珠评价添加了TBS溶液的小鼠IgG（5μg）的回收率。把回收液进行SDS-PAGE，用CBB染色检出结果，按照Protein G固相化磁珠的量回收溶液中小鼠IgG，同时固相化抗体外的蛋白质的磁珠可应用于亲和性实验中。

结语

从以上例子，可看出用使用此方法制作的抗体固相化磁珠可作为免疫沉淀的基础应用于各类实验，并能用于抗体外的蛋白质的亲和性实验里。