应用末端截切、进化、再延长技术提高酶稳定性的方法
丁香园
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1. 引言
如果酶能够被改造使得其稳定性得以提高，它将会得到充分的开发利用。例如，酶能够在比较大的温度范围内具有活性，或者对蛋白酶的敏感性降低从而半衰期得到延长。蛋白质稳定性的提高，如同增加其特异性和反应活性一样，在工业和制药业中是最受关注的特性之一。
目前为止，发现了很多提高蛋白质热稳定性的因素 [ 1~4 ] 。例如，刚性和紧密程度的增加，更多的疏水残基在核心中的引入，以及范德华作用力的增加。此外，蛋白质的热稳定性还可以通过引入金属结合位点或额外的二硫键 [5，6] 、主链环化以及缩短或删除环区等步骤来提高。决定蛋白质高热稳定性的两个主要因素被认为是氢键增加和离子键网络的形成 [ 8~10] 。
然而，由于分子水平上对蛋白质热稳定性仍未有完整的认识，把蛋白质改造成热稳定性高的蛋白质仍然是个难题[ (11 ] 。计算和比较研究法用于识别其稳定作用并已经成功地加以应用 [ 12~14 ] 。然而它们必须依赖于有良好分辨率的晶体或核磁共振结构。结构中能清楚地看到 Cα 的轮廓，并且能获得许多同源序列，最好是嗜热来源的。此外，模拟达尔文优化循环“突变、重组和选择”的进化方法也被用来突破目前蛋白质合理设计的界限 [ 15， 16] 。
1.1 末端截切
由于蛋白质不同，其末端区域对于结构和功能完整性的贡献也有所不同。对有些蛋白质来说，剪切掉末端部分氨基酸并不影响其三维结构和构造稳定性。在这些结构中，其末端部分经常未被定义或是呈无规则卷曲状态。然而，另一些蛋白质对其末端缺失非常敏感。在这种情况下，其末端少数几个氨基酸的缺失就会导致其构象稳定性
极大地降低，从而形成松散结构 [17] ，使其对蛋白酶更加敏感或是更易聚集形成沉淀 [18] 。这种现象已分别在 RNA 酶 A [19 ]、RNA 酶 HI[ 20 ] 、金黄色葡萄球菌核酸酶 R(staphylococcal nuclease R)[17] 、硫氛酸酶 [21，22]、Tag DNA 聚合酶的 Stoffel 片段 [23] 以及氯霉素乙酰转移酶 [18] 中得到证实。尽管部分蛋白质不能缺失其末端的甚至一个氨基酸，对于绝大多数蛋白质来说，其末端氨基酸的缺失会显著影响其表达水平、原始构
象和稳定性，然而在一定范围内仍然有功能（如较低的反应温度）。不过，一旦超越这一范围，末端截切便会导致不可恢复的结构毁坏和功能的完全丧失。因此，仔细选择合适的末端截切可以使绝大多数蛋白质在结构受到干扰的情况下不影响其折叠过程和功能构象。
1.2 定向进化互补对结构的干扰
蛋白质结构可以通过替换、插入和删除氨基酸进行干扰。这种干扰可以通过单个或多个通常被称为全局或第二位抑制子 [ 24 ] 的补救突变来稳定，因为它们能够在远程抑制原本有害突变的表型。这种现象是由于蛋白质结构的髙度复杂性和可塑性以及控制蛋白质结构的蛋白质内部相互作用造成的。并且这也是由蛋白质结构的自身简并特性促成的，蛋白质结构往往由少数几个关键氨基酸决定，而绝大多数氨基酸被替换后并不影响其表型变化。被截切 RNase HI 的第二位点抑制因子已通过随机突变引入并且通过功能筛选得到 [ 20 ]。然而，单纯由随机突变引入的突变，由于其有害突变的积聚而使有功能的蛋白质减少，从而可检测的有益突变将变少。为了克服随机
突变的局限性，一个被称为 DNA 混编的重组方法被引进 [ 15，16 ] 。这在基于 DNA 的蛋白质工程中是一个里程碑。它是不断产生并打乱点突变重复循环过程，被称为体外或定向进化。它基于同样支配着自然进化的原则，即随机突变、重组、筛选或选择。用这种方法，很多酶在活性、专一性、稳定性，甚至在有机溶剂中的功能等方面有显著改进 [ 25 ] 。酶的定向进化比起合理设计有很多优点，因为不需要知道三维结构而能提高酶特性。然而，它仅限用于有合适的筛选过程的酶。
本章总结了一个可控制的、有广泛应用前景的提高酶稳定性的方法。它基于在 DNA 水平上对目标蛋白末端进行截切来实施结构干扰（见 16.3.2 和 16.3.3 ) 。由截切导致的有害突变（见 16.3.4 ) 是由进化的、遗传的体外优化过程来克服的（见 16.3.5)。截切-优化-延长的方法（图 16.1 A ) 优越于其他方法之处在于它的简单性，因为它不依赖于结构信息，也不需要知道同源蛋白。然而，如果目前的数据能够提供这样的信息，截切设计的过程将会更直接，在某些情况下甚至更有效。最后，本章所描述的方法还有一个优点，那就是用该方法得到的热稳定突变体能够在生理温度下筛选而得。
2. 材料
2.1 质粒构建、DNA 混编和随机突变
( 1 ) Pr_sfi_pelB_DG_blawt 的正向引物：5'-TTACTCACGGCCCAGCCGGCCATGGCTGACGGTCACCAGAAACGCTGGTG-3’ ，有下画线的是限制性内切核酸酶位点，黑体为杂交区域。
( 2 ) Pr_sfi_pelB_DG_bladelHPE 的正向引物：5'-TTACTCACGGCCCAGCCGGCCATGGCTGACGG TACGCTGGTGAAAGTAAAAAGATG -3'。
( 3 ) Pr_sfi_pelB_DG_bladelHPETL 的正向引物：5'-TTACTCACGGCCCAGCCGGCCATGGCTGACGG TGTGAAAGTAAAAGATTGCTGAAG-3'。
( 4 ) Pr_blawt_GG_his5_hind 的反向引物：5'-TAGTCAAGCTTACTAGTGATGGTGATGGTGGCCACCCCAATGCTTAATCAGTGAGG-3'。
( 5 ) Pr_bladelW_GG_his5_hind 的反向序列：5'-TAGTCAAGCTTACTAGTGATGGTGATGGTGGCCACCATGCTTAATCAGTGAGGCACC-3’。
( 6 ) Pr_bla_delKHW_GG_his5_hind 的反向序列：5'-TAGTCAAGCTTACTAGTGATGGTGATGGTGGCCACCATGCTTAATCAGTGAGGCACC-3’。
( 7 ) 质粒 pKMENGRbla 是由 pAK400 衍生而来的 [26]。
( 8 ) 限制性内切核酸酶 Sfi I 和 Hind lll。
( 9 ) 质粒 p KJE_Bla-N△5：表达 TEM-1 β-内酰胺酶的 N 端前 5 个氨基酸残基缺失突变体（见 16.3.3) 。
( 10 ) Pr_sfi_ pelB_DG_shuffl 的正向引物：5'-TTACTCACGGCCCAGCCGATGGCTGACG-3'，有下画线的是限制性内切酶位点。
( 11 ) Pr_GG_his5_hind_ shuffl 反向引物：5'-TAGTCAAGCTTACTAGTGATGGTGATGGTGGCCACC-3'。
( 12 ) Taq DNA 聚合酶（Sigma)。
( 13 ) DNase I (Sigma)。
( 14 ) DNase 缓冲液：50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，1 mmol/L MgCl2。
( 15 ) EDTA 溶液：0.5 mol/L EDTA。
( 16 ) 琼脂胶：1%~2% 的琼脂溶在 0.5X Tris-baseboric 酸-EDTA (TBE) 缓冲液。
( 17 ) 10X TBE 缓冲液：1 mol/L Tris-base、1 mol/L boric 酸、20 mmol/L EDIA，pH 8.0。
( 18 ) QiaexII 切胶回收试剂盒（Qiagen) 。
( 19 ) dNTP (Amersham)。
( 20 ) 水浴锅（Epperndorf)。
( 21 ) MgCl2 储液：25~100 mmol/L MgCl2。
( 22 ) MnCl2 储液：5 mmol/L MnCl2。
( 23 ) GFX PCR DNA 和切胶回收试剂盒。
2.2 转化、蛋白质表达和纯化
( 1 ) 丁醇。
( 2 ) 电感受态大肠杆菌 XL-1 Blue 细胞。
( 3 ) Electroporator ( Bio- Rad) 。
( 4 ) 2YT：16 g 胰化（蛋白）胨、10 g 酵母提取物、5 g NaCl 溶于 1 L 水中；高压灭菌。
( 5 ) 转化盐储液：250 mmol/L KCl 和 1 mol/L MgCl2。
( 6 ) 氨芐储液：将 100 mg/ml 氨苄溶于水用 0.22 μm 过滤器过滤，分装，-20°C 储存。
( 7 ) LB/Cm 固体板：1% 胰化（蛋白）胨、0.5% 酵母提取物、0.5% NaCl、1.5% 琼脂、25 μg/ml 氯霉素。
( 8 ) LB/Cm：1% 胰化（蛋白）胨、0.5% 酵母提取物、0.5% NaCl、1.5% 琼脂、25 μg/ml 氯霉素。
( 9 ) 2YT/Cm：2YT 培养基中加入 25 μg/ml 氯霉素。
( 10 ) 高速离心机（Sorvall、GS-3 和 SS -34 转子）。
( 11 ) 悬浮缓冲液：50 mmol/L 磷酸钠、500 mmol/L NaCl，pH 7.0。
( 12 ) Benzonase ( Sigma)。
( 13 ) 0.45 μm 磺酸多醚注射过滤器。
( 14 ) 2 ml 苯硼酸柱子。
( 15 ) 硼酸缓冲液：0.5 mol/L 硼酸、0.5 mol/L NaCl，pH 7.0。
( 16 ) 4 ml Ni-氨基三乙酸（NTA) 柱子：4 ml Ni-NTA 高流速介质（Qiagen)。
( 17 ) 咪唑缓冲液：50 mmol/L 磷酸钠、0.25 mol/L 咪唑、50 mmol/L NaCl，pH 7.0。
( 18 ) 磷酸缓冲液：50 mmol/L 磷酸钠、150 mmol/L NaCl，pH 7.2。
( 19 ) EDTA。
( 20 ) 1 ml 苯氯仿 HR 5/5 柱子（Amersham- Pharmacia)。
( 21 ) Tris-HCl 缓冲液：25 mmol/L Tris-HCl、25 mmol/L NaCl，pH 8.0。
( 22 ) Mono Q HR5/5 柱子（Amersham- Pharmacia)。
( 23 ) Tris-HCl-NaCl 缓冲液：25 mmol/L Tris-HCl、0.5 mmol/L NaCl，pH 8.0。
2.3 酶活体系及尿素诱导的去折叠
( 1 ) 头孢尼特罗溶液：0.2 mmol/L 头孢硝噻吩、50 mmol/L 磷酸钾、0.5% 二甲基亚砜，pH 7.0。
( 2 ) 分光光度仪：至少能 1s 读 1 次数值，如，Ultrospec 3000 (Amersham- Pharmacia) 或 V-550 ( Jasco)。
( 3 ) 分光荧光计，如，FluoroMax-2 ( Jobin- Yvon) 或 FP-6500 ( Jasco)。
( 4 ) 磷酸缓冲液 [ 见 16.2.2 (18)]。
( 5 ) 尿素：超纯，至少 99% 纯度（ICN )。
4. 注
1. 为了确保生长结果可以比较，需要有一个统一起始条件的预菌液。
2. 经过分析 2529 个碱基，混编过程的错误率是 0.83。
3. 在延长温浴时间（15 min) 的情况下，洗脱的结合的 DNA 片段随着温浴温度的升髙而增加，如 50°C。
4. 不需要额外引物来辅助分离的 DNA 片段之间互为引物并混编。
5. Mg2+ 的增加能稳定没有配对的碱基对，然而 0.5 mmol/L Mg2+ 会降低聚合酶对模板的亲和力。错误率可以在广泛的范围内得到控制。例如，通过改变模板分子数、循环次数、延伸的时间、聚合酶的来源及用量、dNTP 的不同比例以及 dNTP 类似物的采用等。错误率仍然与目标基因的核苷酸组成是相关的。因此同样的操作在不同的
实验中会得到完全不同的结果。
6. 如果第一次循环后酶活反应很低，可在溶液状态（LB/Cm 加入不同浓度的氨苄）下进行筛选，因为溶液的筛选压力比固体培养基的要少。
7. 未加工完全的蛋白质百分比可通过扫描考马斯亮蓝染色的胶，用 Scion/NIH 成像系统来定量。
8. 如果在低于 37°C 下表达，最好把过夜培养菌也在相对较低的温度下培养以避免出现表达培养时的滞后现象。
9. 优化表达温度可通过对各个突变体在不同的温度下培养少量培养物来调整。
10. 在两个 pH (7.0 和 7.2 ) 下检测，得到相同的结果。
11. 1 mol/L (NH4)2SO4 可确保正确的结合，但是如果蛋白质容易聚集，可以适当降低（(NH4)2SO4 浓度。因为在野生型 β-内酰胺酶中加入 0.5 mol/L (NH4)2SO4 时就开始沉淀，所以 (NH4)2SO4 的最终使用浓度为 0.65 mol/L 。在这个实验中，自然的蛋白质存在于穿出峰中，而没有加工完全的蛋白质则保留在柱子上。
12. 吸收谱测定的范围是 350~220 nm。在 280 nm 的背景吸收是通过用 320 nm 和 350 nm 之间的吸收与 280 nm 的吸收线性外推来校正的。摩尔消光系数和分子量是根据 Gill 和 Hippel 来计算得到的 [45]。
13. 对于半衰期短的酶来说，反应的头几秒非常重要，所以加入酶后应立即检测。另外，应该使用每秒至少能读一次数据的分光光度仪。
14. 酶学反应的衰减是利用 SigmaPlot 中的三参数指数衰减来拟合的。
15. 根据每纳米所需要的数据数目，各种参数需要被调节。另一种方法是用滑动平均数来平滑数据。除了要确定 λmax，我们也测定了 330~370 nm 的重心迁移。尽管用了更多的数据，但这种方法并不一定能给出更好的结果。
17. 为了说明两个荧光剂之间绝对最大值的微小变化，标准化的部分去折叠。图标中给出了公式：funfold=（yobs-yF）/（yU-yF）。
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然而，由于分子水平上对蛋白质热稳定性仍未有完整的认识，把蛋白质改造成热稳定性高的蛋白质仍然是个难题[ (11 ] 。计算和比较研究法用于识别其稳定作用并已经成功地加以应用 [ 12~14 ] 。然而它们必须依赖于有良好分辨率的晶体或核磁共振结构。结构中能清楚地看到 Cα 的轮廓，并且能获得许多同源序列，最好是嗜热来源的。此外，模拟达尔文优化循环“突变、重组和选择”的进化方法也被用来突破目前蛋白质合理设计的界限 [ 15， 16] 。
1.1 末端截切
由于蛋白质不同，其末端区域对于结构和功能完整性的贡献也有所不同。对有些蛋白质来说，剪切掉末端部分氨基酸并不影响其三维结构和构造稳定性。在这些结构中，其末端部分经常未被定义或是呈无规则卷曲状态。然而，另一些蛋白质对其末端缺失非常敏感。在这种情况下，其末端少数几个氨基酸的缺失就会导致其构象稳定性
极大地降低，从而形成松散结构 [17] ，使其对蛋白酶更加敏感或是更易聚集形成沉淀 [18] 。这种现象已分别在 RNA 酶 A [19 ]、RNA 酶 HI[ 20 ] 、金黄色葡萄球菌核酸酶 R(staphylococcal nuclease R)[17] 、硫氛酸酶 [21，22]、Tag DNA 聚合酶的 Stoffel 片段 [23] 以及氯霉素乙酰转移酶 [18] 中得到证实。尽管部分蛋白质不能缺失其末端的甚至一个氨基酸，对于绝大多数蛋白质来说，其末端氨基酸的缺失会显著影响其表达水平、原始构
象和稳定性，然而在一定范围内仍然有功能（如较低的反应温度）。不过，一旦超越这一范围，末端截切便会导致不可恢复的结构毁坏和功能的完全丧失。因此，仔细选择合适的末端截切可以使绝大多数蛋白质在结构受到干扰的情况下不影响其折叠过程和功能构象。
1.2 定向进化互补对结构的干扰
蛋白质结构可以通过替换、插入和删除氨基酸进行干扰。这种干扰可以通过单个或多个通常被称为全局或第二位抑制子 [ 24 ] 的补救突变来稳定，因为它们能够在远程抑制原本有害突变的表型。这种现象是由于蛋白质结构的髙度复杂性和可塑性以及控制蛋白质结构的蛋白质内部相互作用造成的。并且这也是由蛋白质结构的自身简并特性促成的，蛋白质结构往往由少数几个关键氨基酸决定，而绝大多数氨基酸被替换后并不影响其表型变化。被截切 RNase HI 的第二位点抑制因子已通过随机突变引入并且通过功能筛选得到 [ 20 ]。然而，单纯由随机突变引入的突变，由于其有害突变的积聚而使有功能的蛋白质减少，从而可检测的有益突变将变少。为了克服随机
突变的局限性，一个被称为 DNA 混编的重组方法被引进 [ 15，16 ] 。这在基于 DNA 的蛋白质工程中是一个里程碑。它是不断产生并打乱点突变重复循环过程，被称为体外或定向进化。它基于同样支配着自然进化的原则，即随机突变、重组、筛选或选择。用这种方法，很多酶在活性、专一性、稳定性，甚至在有机溶剂中的功能等方面有显著改进 [ 25 ] 。酶的定向进化比起合理设计有很多优点，因为不需要知道三维结构而能提高酶特性。然而，它仅限用于有合适的筛选过程的酶。
本章总结了一个可控制的、有广泛应用前景的提高酶稳定性的方法。它基于在 DNA 水平上对目标蛋白末端进行截切来实施结构干扰（见 16.3.2 和 16.3.3 ) 。由截切导致的有害突变（见 16.3.4 ) 是由进化的、遗传的体外优化过程来克服的（见 16.3.5)。截切-优化-延长的方法（图 16.1 A ) 优越于其他方法之处在于它的简单性，因为它不依赖于结构信息，也不需要知道同源蛋白。然而，如果目前的数据能够提供这样的信息，截切设计的过程将会更直接，在某些情况下甚至更有效。最后，本章所描述的方法还有一个优点，那就是用该方法得到的热稳定突变体能够在生理温度下筛选而得。
2. 材料
2.1 质粒构建、DNA 混编和随机突变
( 1 ) Pr_sfi_pelB_DG_blawt 的正向引物：5'-TTACTCACGGCCCAGCCGGCCATGGCTGACGGTCACCAGAAACGCTGGTG-3’ ，有下画线的是限制性内切核酸酶位点，黑体为杂交区域。
( 2 ) Pr_sfi_pelB_DG_bladelHPE 的正向引物：5'-TTACTCACGGCCCAGCCGGCCATGGCTGACGG TACGCTGGTGAAAGTAAAAAGATG -3'。
( 3 ) Pr_sfi_pelB_DG_bladelHPETL 的正向引物：5'-TTACTCACGGCCCAGCCGGCCATGGCTGACGG TGTGAAAGTAAAAGATTGCTGAAG-3'。
( 4 ) Pr_blawt_GG_his5_hind 的反向引物：5'-TAGTCAAGCTTACTAGTGATGGTGATGGTGGCCACCCCAATGCTTAATCAGTGAGG-3'。
( 5 ) Pr_bladelW_GG_his5_hind 的反向序列：5'-TAGTCAAGCTTACTAGTGATGGTGATGGTGGCCACCATGCTTAATCAGTGAGGCACC-3’。
( 6 ) Pr_bla_delKHW_GG_his5_hind 的反向序列：5'-TAGTCAAGCTTACTAGTGATGGTGATGGTGGCCACCATGCTTAATCAGTGAGGCACC-3’。
( 7 ) 质粒 pKMENGRbla 是由 pAK400 衍生而来的 [26]。
( 8 ) 限制性内切核酸酶 Sfi I 和 Hind lll。
( 9 ) 质粒 p KJE_Bla-N△5：表达 TEM-1 β-内酰胺酶的 N 端前 5 个氨基酸残基缺失突变体（见 16.3.3) 。
( 10 ) Pr_sfi_ pelB_DG_shuffl 的正向引物：5'-TTACTCACGGCCCAGCCGATGGCTGACG-3'，有下画线的是限制性内切酶位点。
( 11 ) Pr_GG_his5_hind_ shuffl 反向引物：5'-TAGTCAAGCTTACTAGTGATGGTGATGGTGGCCACC-3'。
( 12 ) Taq DNA 聚合酶（Sigma)。
( 13 ) DNase I (Sigma)。
( 14 ) DNase 缓冲液：50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，1 mmol/L MgCl2。
( 15 ) EDTA 溶液：0.5 mol/L EDTA。
( 16 ) 琼脂胶：1%~2% 的琼脂溶在 0.5X Tris-baseboric 酸-EDTA (TBE) 缓冲液。
( 17 ) 10X TBE 缓冲液：1 mol/L Tris-base、1 mol/L boric 酸、20 mmol/L EDIA，pH 8.0。
( 18 ) QiaexII 切胶回收试剂盒（Qiagen) 。
( 19 ) dNTP (Amersham)。
( 20 ) 水浴锅（Epperndorf)。
( 21 ) MgCl2 储液：25~100 mmol/L MgCl2。
( 22 ) MnCl2 储液：5 mmol/L MnCl2。
( 23 ) GFX PCR DNA 和切胶回收试剂盒。
2.2 转化、蛋白质表达和纯化
( 1 ) 丁醇。
( 2 ) 电感受态大肠杆菌 XL-1 Blue 细胞。
( 3 ) Electroporator ( Bio- Rad) 。
( 4 ) 2YT：16 g 胰化（蛋白）胨、10 g 酵母提取物、5 g NaCl 溶于 1 L 水中；高压灭菌。
( 5 ) 转化盐储液：250 mmol/L KCl 和 1 mol/L MgCl2。
( 6 ) 氨芐储液：将 100 mg/ml 氨苄溶于水用 0.22 μm 过滤器过滤，分装，-20°C 储存。
( 7 ) LB/Cm 固体板：1% 胰化（蛋白）胨、0.5% 酵母提取物、0.5% NaCl、1.5% 琼脂、25 μg/ml 氯霉素。
( 8 ) LB/Cm：1% 胰化（蛋白）胨、0.5% 酵母提取物、0.5% NaCl、1.5% 琼脂、25 μg/ml 氯霉素。
( 9 ) 2YT/Cm：2YT 培养基中加入 25 μg/ml 氯霉素。
( 10 ) 高速离心机（Sorvall、GS-3 和 SS -34 转子）。
( 11 ) 悬浮缓冲液：50 mmol/L 磷酸钠、500 mmol/L NaCl，pH 7.0。
( 12 ) Benzonase ( Sigma)。
( 13 ) 0.45 μm 磺酸多醚注射过滤器。
( 14 ) 2 ml 苯硼酸柱子。
( 15 ) 硼酸缓冲液：0.5 mol/L 硼酸、0.5 mol/L NaCl，pH 7.0。
( 16 ) 4 ml Ni-氨基三乙酸（NTA) 柱子：4 ml Ni-NTA 高流速介质（Qiagen)。
( 17 ) 咪唑缓冲液：50 mmol/L 磷酸钠、0.25 mol/L 咪唑、50 mmol/L NaCl，pH 7.0。
( 18 ) 磷酸缓冲液：50 mmol/L 磷酸钠、150 mmol/L NaCl，pH 7.2。
( 19 ) EDTA。
( 20 ) 1 ml 苯氯仿 HR 5/5 柱子（Amersham- Pharmacia)。
( 21 ) Tris-HCl 缓冲液：25 mmol/L Tris-HCl、25 mmol/L NaCl，pH 8.0。
( 22 ) Mono Q HR5/5 柱子（Amersham- Pharmacia)。
( 23 ) Tris-HCl-NaCl 缓冲液：25 mmol/L Tris-HCl、0.5 mmol/L NaCl，pH 8.0。
2.3 酶活体系及尿素诱导的去折叠
( 1 ) 头孢尼特罗溶液：0.2 mmol/L 头孢硝噻吩、50 mmol/L 磷酸钾、0.5% 二甲基亚砜，pH 7.0。
( 2 ) 分光光度仪：至少能 1s 读 1 次数值，如，Ultrospec 3000 (Amersham- Pharmacia) 或 V-550 ( Jasco)。
( 3 ) 分光荧光计，如，FluoroMax-2 ( Jobin- Yvon) 或 FP-6500 ( Jasco)。
( 4 ) 磷酸缓冲液 [ 见 16.2.2 (18)]。
( 5 ) 尿素：超纯，至少 99% 纯度（ICN )。
4. 注
1. 为了确保生长结果可以比较，需要有一个统一起始条件的预菌液。
2. 经过分析 2529 个碱基，混编过程的错误率是 0.83。
3. 在延长温浴时间（15 min) 的情况下，洗脱的结合的 DNA 片段随着温浴温度的升髙而增加，如 50°C。
4. 不需要额外引物来辅助分离的 DNA 片段之间互为引物并混编。
5. Mg2+ 的增加能稳定没有配对的碱基对，然而 0.5 mmol/L Mg2+ 会降低聚合酶对模板的亲和力。错误率可以在广泛的范围内得到控制。例如，通过改变模板分子数、循环次数、延伸的时间、聚合酶的来源及用量、dNTP 的不同比例以及 dNTP 类似物的采用等。错误率仍然与目标基因的核苷酸组成是相关的。因此同样的操作在不同的
实验中会得到完全不同的结果。
6. 如果第一次循环后酶活反应很低，可在溶液状态（LB/Cm 加入不同浓度的氨苄）下进行筛选，因为溶液的筛选压力比固体培养基的要少。
7. 未加工完全的蛋白质百分比可通过扫描考马斯亮蓝染色的胶，用 Scion/NIH 成像系统来定量。
8. 如果在低于 37°C 下表达，最好把过夜培养菌也在相对较低的温度下培养以避免出现表达培养时的滞后现象。
9. 优化表达温度可通过对各个突变体在不同的温度下培养少量培养物来调整。
10. 在两个 pH (7.0 和 7.2 ) 下检测，得到相同的结果。
11. 1 mol/L (NH4)2SO4 可确保正确的结合，但是如果蛋白质容易聚集，可以适当降低（(NH4)2SO4 浓度。因为在野生型 β-内酰胺酶中加入 0.5 mol/L (NH4)2SO4 时就开始沉淀，所以 (NH4)2SO4 的最终使用浓度为 0.65 mol/L 。在这个实验中，自然的蛋白质存在于穿出峰中，而没有加工完全的蛋白质则保留在柱子上。
12. 吸收谱测定的范围是 350~220 nm。在 280 nm 的背景吸收是通过用 320 nm 和 350 nm 之间的吸收与 280 nm 的吸收线性外推来校正的。摩尔消光系数和分子量是根据 Gill 和 Hippel 来计算得到的 [45]。
13. 对于半衰期短的酶来说，反应的头几秒非常重要，所以加入酶后应立即检测。另外，应该使用每秒至少能读一次数据的分光光度仪。
14. 酶学反应的衰减是利用 SigmaPlot 中的三参数指数衰减来拟合的。
15. 根据每纳米所需要的数据数目，各种参数需要被调节。另一种方法是用滑动平均数来平滑数据。除了要确定 λmax，我们也测定了 330~370 nm 的重心迁移。尽管用了更多的数据，但这种方法并不一定能给出更好的结果。
17. 为了说明两个荧光剂之间绝对最大值的微小变化，标准化的部分去折叠。图标中给出了公式：funfold=（yobs-yF）/（yU-yF）。
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