材料与仪器
质粒
DNase 缓冲液 EDTA 溶液 TBE 缓冲液 丁醇 转化盐储液 氨芐储液 悬浮缓冲液 硼酸缓冲液
水浴锅 分光光度仪 分光荧光计
DNase 缓冲液 EDTA 溶液 TBE 缓冲液 丁醇 转化盐储液 氨芐储液 悬浮缓冲液 硼酸缓冲液
水浴锅 分光光度仪 分光荧光计
步骤
本章主要介绍提高蛋白质热稳定性的常规方法，而不需要在高温下筛选酶活性。介绍完 β 内酰胺酶模型系统（见 16.3.1 )，我们描述末端截切（见 16.3.2 和 16.3.3 ) 的设计方案，它们对酶活的影响（见 16.3.4 )。突变库由酶的定向进化和错误向 PCR 产生（见 16.3.5)，然后在体内应用不同的筛选压力进行筛选（见 16.3.6)。在本节的最后一部分讨论截切突变体的再延长（见 16.3.7)、表达策略和纯化方案、酶学方法 ( 见 16.3.9 ) 以及稳定性检测（见 16.3.10)。
3.1 β-内酰胺酶模型系统
为了说明截切- 优化-再延长可以用来提高蛋白质的热稳定性，内酰胺酶被选作模型系统（图 16.1A )。作为一个临床发病机制相关的研究因子和重要的抗体，它所属的家族已被广泛研究，多个晶体结构已解析。许多对该酶的突变已被用于更好地研究和解释结构-功能相关性以及理性设计截切片段。此外，稳定的 β-内酰胺酶还被用于癌症治疗的潜在药物的活性研究，以便得到潜在的药物前体化合物 [ 27，28 ] 。
β-内酰胺酶的 A 家族（EC 3.5.2.6 ) 是细菌胞质酶，其氨基酸序列多样化，稳定性不同，但其三维结构很相似。尽管 β-内酰胺酶的 A 家族的肽主链在核心区能很好地重叠在一起，但在两个末端并没有很好的重叠性。末端结构的不同也与氨基酸长度和氨基酸组成相符合，让这类酶适合于研究序列同源和功能的相关重要性。
3.2 设计末端截切
缺失突变体的正确设计很重要：如果末端截切的过多，由于结构稳定性不够和错误折叠，其得到的截切突变体将没有功能；同样，如果截切的不够多，很有可能得不到期望的表型，选择压力将无法选择出稳定的结构。
如果目标蛋白的结构已被解析，可用 Protein Data Bank (PDB；http : //www.pdb.org/)，SWISSPROT ( http ： //www. expasy. org/sprot/和 http : //www.ebi. ac.uk/swissprot) 以及 SCOP ( http : //scop. mrc-lmb. cam . ac . uk/ scop/ ) 等数据库以及结构分析工具，如分子模型程序 WHATIF (http : //swift cmbi.
kuru nl/WIWWWI) 和 CE 运算法（http : //cl. sdsc . edu /ce . html) ，来进行结构比较和分析。另外，接触图可用作识别可能的非重要和重要的相互作用，这些在设计过程也很重要。如果没有高分辨结构，可用其他的数据 库（如 HSSP) 和 SWISS MODEL 同源模型服务器（http : //swissmodel. expasy. org) , 或者用一个或两个氨
基酸逐切来决定最大截切数。
在该研究中，根据以前的 β-内酰胺酶的突变体研究 [29] 而设计 4 个截切突变体，对 β-内酰胺酶的 A 家族进行结构同源序列比对，用 CE 运算法 [ 30 ] 和 SWIS& PDB 浏览器 [31] (http : //ww w. expasy. org/spdbv) ( 图 16.1B 和图 16.1C) 来分析结构。截切的突变体试图在生理温度下引入结构干扰而不会使蛋白质完全没有功能。N 端前 3 个氨基酸（ His、Pro 和 Glu) 有很高的温度因子（高达 23.8A，平均 13.1A )和溶剂可接触性（PDB 号1btl )，当去掉前 3 个氨基酸得到的突变体 N△3 对蛋白质稳定性的影响比较小。N△5 突变体去掉临近的苏氨酸和亮氨酸，其中苏氨酸被完全掩盖并与 C 端的 Ser285 氨基酸形成氢键。在 C 端，只有 1 个和 3 个氨基酸被去掉 （突变体 C△1 和 C△3 )，因为以前的研究表明末端酪氨酸是关键的氨基酸 [32] 。
3. 载体质粒的设计
载体质粒被设计为当野生型 β-内酰胺酶或截切的突变体与用于细胞间质定位的 N 端 pelB 信号序列融合表达。一 个短的天冬氨酸-甘氨酸的链接被引入用来确保 N 端不同的突变体同等的处理效率。最后，C 端连接 His-tag 可用于固定金属离子亲和柱来纯化，甚至能够纯化非野生型的 β-内酰胺酶变体（图 16.2A)。
载体构建步骤如下：
( 1 ) TEM-1β-内酰胺酶截切突变体 NA3、N△5 和 C△1 及 C△3 是由 pUC 衍生的 TEM-1 基因扩增而来，分别用其正向和反向引物。正向引物含 5' Sfi I 酶切位点，还包含 pelB 信号肽链的 C 端编码序列和 TEM-1 截切突变体的 N 端修饰（截切）序列。在基因的 3' 端，包含反向序列编码改造的 TEM-1 的 C 端序列、1 个短的序列（2 个甘氨酸残基）、5 个 His-tag、2 个终止密码子和 Hind lll 酶切位点。
( 2 ) 其 PCR 产物由 Sfi I/Hind III 双酶切、纯化，然后克隆到 pKMENGRbla (由 K.M.M. 提供）载体中，pKMENGRbla 是由表达载体 pKA400 [ 26 ] 改造而来，含有 1 个氯霉素抗性基因。
得到的质粒（pKJE_Bla—NA/CA 系列）在 lac 操纵子下表达了各种 TEM-1 突变体基因。尽管质粒上的 lacI 有组成型表达，强的 T7g10 Shine-Dalgarno 序列 [ 35 ] 有很高的表达水平，因此所有选择步骤在极端条件下进行，并未过表达。
3.4 末端截切对酶活性的影响
为了检测末端截切对酶活性的影响，在氨苄抗性递增的固体培养基和液体培养基中测其生长速度。通常，在固体板上的筛选比液体状态下更为苛刻。通过本底表达及 IPTG 诱导表达以及在不同温度下的诱导来观察体系的不同。
( 1 ) 如果有需要，用标准方法转化 BL21 细胞涂在 LB/Cm 板上。
( 2 ) 从甘油菌或者转化的过夜（16 h) 培养的 LB/Cm 板上 [ 步骤（1 ) ] 挑取单克隆。
( 3 ) 将过夜培养的菌，在新培养基中稀释至 OD600 为 0.1，并将其培养至 OD600 为 1 ( 见注 1)。
( 4 ) 将预培养的菌液 [ 步骤（3 ) ] 涂在含 IPTG 与不含 IPTG 的不同浓度的氨苄抗性板上。被涂的菌量可估量为 2.5X108 个细胞/ml，1 个 OD600。
( 5 ) 在液体 LB/Cm 培养基中加入步骤（3 ) 的菌液，在含 IPTG 与不含 IPTG 的不同浓度的氨苄培养基中培养。
( 6 ) 生长速率 [ 步骤（4 ) 和（5 ) ] 可以在不同温度下重复。
在不诱导情况下，于固体板上 37°C 培养，当氨苄抗性浓度从 0 μg/ml 增加到 50 μg/ml 时，所有截切突变体的克隆数急剧减少（图 16.2B) 。在连续培养 40 h 后突变体 N△5 和 C△3 没有长出克隆，说明了末端氨基酸的重要性。当 25°C 诱导时，N△5 能够在高达 50 μg/ml 的氨苄固体培养基中生长，在 37°C 液体培养基中在合适的供氧情况下仍能生长。这说明两个截切突变体都能干扰蛋白质结构，但同时可以折叠成有活性的结构。N△5 突变体比 C△3 对抗生素的容忍性更小，因此更适合于下一步的优化。
3.5 DNA 混编和随机突变
逆转由末端截切或删除突变造成的结构干扰的关键优化步骤是在遗传水平上建立高度可变的突变库。随机突变与 DNA 重组的结合能够满足这样的突变需求。
DNA 混编 [ 15，16 ] 是在试管里进行 DNA 重组的广泛应用的方法。由 DNA 混编方法将不同源的基因混杂在一起是定向进化中的关键步骤，其主要特点简述如下：在全基因上进行随机点突变后，主要是由易错 PCR ( 见 16.3.7 ) 引入突变得到的突变库可用来 DNA 片段化，从而得到小的、略微不同的、可相互交换的、长度为 50~200 个碱基对的 DNA 片段。将一个或多个核苷酸不同的同源序列交迭并用 PCR 重新扩增成长片
段，起初用低温退火来确保最小的片段也能够进行 PCR。随着循环次数的增加，将退火温度逐步提髙来选择长的交迭片段。最后，用基因两侧的引物合成全长的基因，并引入合适的酶切位点进行下一步的克隆。
以下内容介绍用易错 PCR 和 DNA 混编来创建有足够复杂度、多样化的突变库。值得注意的是，这里介绍的步骤只针对我们的系统，随着目标基因的长度和组成需要有所改变。需要考虑在易错 PCR 引进突变之前反应的覆盖率，第一次随机突变，第二次组合是不能用来决定混编过程中的错误率的（见注 2 )。
( 1 ) 得到足够量（5~10 μg）的目标基因，可用目标基因两端的同源序列 PCR 或者用限制性内切核酸酶基因末端剪切。如果用 PCR 方法，应该用 Taq DNA 聚合酶来合成产物。在我们的例子中，我们以 pKJE_Bla_N△5 为模板，用引物 Pr_sfi_pelB_DG_ shuffl 和 Pr_GG_his5 _ hind_shuffl 扩增截切的 β-内酰胺酶。
( 2 ) 将 4~5 μg 的目标基因用 0.2 U 的 DNase l 在 50 μl DNaSe I 的酶切体系中，于室温（25°C) 下酶切 12 min。
( 3 ) 加入 4 μl 的 EDTA 溶液终止内切酶反应，并在冰上放置。
( 4 ) 将得到的 DNA 片段在 2% 的琼脂胶上分析并回收长度为 50~150 bp 的 DNA 片段。
( 5 ) 用 Qiaex II 胶回收试剂盒回收 DNA 片段（见注 3)。
( 6 ) 在 50 μl 体系中，加入约 100~300 μg 的纯化的片段用来作引物延伸 PCR ( 见注 4)。反应混合物包括 2.5 U DNA 聚合酶、0.4 mmol/L dNTP 2 mmol/L MgCl2。在 PCR 仪（Eppendorf) 中，PCR 反应用以下程序进行：94°C 3min；94°C 1 min ( 变性），（ 45 + 0.3 )°C 每个循环 1 min (退火），72°C 1 min (延伸）（10 个循环）；最后一个循环后 72°C 5 min；94°C 1 min，（50+0.4)°C 每个循环 1 min，72°C 1 min (15 个循环）；最后一个循环后 72°C 5 min；94°C 1 min，（56+0.5)°C 每个循环 1 min，72°C 1 min (10 个循环）；最后一
个循环后 72°C 5 min；94°C 1 min， ( 61 + 0.5 )°C 每个循环 2 min，72°C 2 min (10 个循环）；最后一个循环后 72°C 5 min。另外，一个简单程序，如 94°C 3 min，35 个循环：92°C 30s，(30 + 1 )°C 每个循环 1 min ，72°C 1 min + 4s/循环，最后一个循环后 72°C 5 min。
( 7 ) 扩增 1/5 体积的重叠的 PCR 反应物（不需要纯化）来扩增全长基因，并加入合适的酶切位点以便下一步克隆。这步可在易错倾向条件下进行，以便扩增突变库的多样化。除了用 Taq DNA 聚合酶延长外，扩增反应的突变率可通过 7 mmol/L MgCl2、0.5 mmol/L MnCl2 的加入而提高( 见注5)。在我们的例子中，我们用引物 Pr_sfi_
pelB_DG_shuffl 和 Pr_GG_his5_hind_shuffl，每条引物的浓度是 0.5 μmol/L。反应混合物包括 7 mmol/L MgCl2、0.5 mmol/L MnCl2、0.4 mmol/L dNTP 和 2.5U Tag。所用的程序是 94°C 3 min，25 个循环：94°C 1 min , 68°C 1 min，72°C 1 min，最后一个循环后 72°C 7 min。
( 8 ) 用 GFX PCR DNA 和切胶回收试剂盒来纯化 PCR 产物，用合适的酶酶切产物，克隆到表达载体中。用16.3.6 所述方法进行转化。
我们进行了 3 个循环的定向进化（S1~S3)，用 DNA 混编和随机突变并结合体内筛选过程。所得到的克隆被收集，作为下一步进化的模板。在定向进化的最后一个循环中，DNA 混编后的易错 PCR 被标准的 PCR 程序取代，防止在重组的克隆中产生有害突变。
16.3.6 转化及在体内筛选突变库
( 1 ) 把质粒突变库，用丁醇沉淀。用 10~20 μl 连接混合物，加入双倍量的去离子水使体积达到 50 μl。加入 500 μl 丁醇在室温离心 2000 g，30 min。去掉上清液，在室温晾干，加入 10~20 μl 的水。
( 2 ) 将沉淀后的 DNA 加入到 100 μl 电转感受态 E.coli XL-1 蓝细胞中。1.7 kV，200Ω，25 μF。转化完后立即加入 900 μl 的 2YT 培养基和 1/100 体积的转化盐储液。
( 3 ) 将悬浮的细胞加入 10 ml 玻璃试管中，在 37°C 培养 60~70 min。
( 4 ) 通过将转化产物逐步稀释涂在 LB/Cm 板上来检测转化效率。
( 5 ) 用另一管转化的细胞涂在不同浓度的氨苄抗性 LB/Cm 板上来检测筛选压力( 见注 6)。选择在最高氨苄浓度下长出来的突变体来进行下一步实验。
( 6 ) 作为筛选，把转化的细胞涂在不同浓度的氨苄抗性 LB/Cm 板上 [ 由步骤（5 )得到的浓度 ] ( 见注 6 )。我们用的氨苄在第一到第三次筛选的浓度分别为 20 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml。第一次的筛选是在液体培养基中进行，后两次筛选是在固体培养基上。
突变体 N△5 经过 3 个循环的定向进化（包括随机突变和 DNA 混编）（见 16.3.5)，被损功能得以恢复。在这 3 个循环中得到 19X103 个，147X103 个和 260X103 个的克隆，分别在 20 μg/ml，100 μg/ml 和 200 μg/ml 氨苄抗性板上生长 [ 步骤（6 )]，得到 3600~7000个克隆。
表 16.1 总结了所有在 3 个混编循环（S1~S3 ) 的定向进化中得到的克隆的测序结果。另外，表 16.1 还包括了每个野生型残基的相对溶剂可接触性和平均侧链原子温度因子（由 PDB 1btl )[ 37] 。其中在第二个循环后的 5 个突变体有两个突变，M182T 和 T265M ( 根据 Ambler et al. 命名，这两个突变在第一次循环后已经存在。
经过最后优化步骤，收集突变库，在不用 IPTG 诱导的情况下，决定最大氨苄抗性浓度，见 16.3.4 ( 图 16.3)。能长出显著数目的克隆数的抗性是 700 μg/ml，经过 40 h 的培养，克隆可在含 1000 μg/ml 的抗性上生长。相比，野生型只能在 500 μg/ml 的抗性上生长。从含 800 μg/ml 和 1000 μg/ml 的抗性板上挑取 26 个克隆，并测序。26 个克隆属于 15 个不同的突变体（表 16.1)。所有的克隆有两个共同的突变位点，M 182T 和 A224V。以
前的研究表明 M182T 突变体能够互补折叠缺陷 [39] 和稳定性缺失 [ 29，40 ]。突变体 A224V 在第三次循环中提高选择压力。这个突变体曾经被提到过，但并没有实验数据证实 [41]。
两个突变体离截切的位点有 17A 的距离，表明是由截切引起的结构干扰的独立互补。图 16.4 是对 TEM- 1β-内酰胺酶最常用的一些突变残基。通常，在单独优化的突变体中矢变在在在整个结构中分布，而不是局部聚集在一起。
3.7 全长突变体的构建
优化的 N△5-S3/6 被再延长来研究突变对被截切后的不稳定蛋白质的互补作用。根据图 16.2A，被截切的氨基酸重新被加上，从而得到全长基因——被命名为 FL-S3/6 的克隆。这个突变体定位在细胞间质，在 E.coli XL-1 Blue 中表达来检测体内功能。让人意外的是，在含氯霉素和 100 μg/ml 氨苄板上于 37°C 20 h 生长的克隆数目只有不含氨苄的对照板上的 50%。这和 N△5-S 3/6 在两个板上得到相同数目克隆成鲜明对比。为了研究蛋白质
功能和蛋白质定位，对 FL-S 3/6 和 N△5 - S3/6 的细胞粗提液做酶活反应。没有看到对发色底物头孢硝噻吩的水解反应的区别，说明酶的定位是很重要的。与这些数据相符合的是在 FL- S 3/6 的纯化过程中也能看到信号肽剪切的减少（见 16.3.8)。因此，可在细胞质内表达的 FL- S3/6-cyt 被克隆，该克隆用甲硫氨酸替代了信号肽以及Asp- Gly tag。为了保证在生理条件下正确的对比，与野生型内酰胺酶类似的基因（wt- done-cyt) 也被克隆。
3.8 蛋白质表达及纯化
β-内酰胺酶突变体（野生型间质定位的、野生型胞质定位的、N△5、优化的 N△5-S3/6、N△5- S5/S7 和 FL-S3/6 胞质定位的突变体）在 lac 启动子下于 E.coli 细胞中带 His -tag 融合表达（见 16.3.8.1)。通过两步纯化反应进行纯化，首先用底物相似的亲和层析苯基硼酸盐柱子（见 16.3.8.2 )，再用 IMAC ( 见 16.3.8.3 )。这种纯化步骤非
常适用于 N△5 (图 16. 5 ) 和 N△5- S3/7 突变体的纯化。
对于某些 β-内酰胺酶突变体（野生型、N△5- S3/6、FL-S3/6)，其纯化的蛋白质有很高的污染并呈未加工完全的形态（30%~ 65% ; 见注 7 )，极可能是因为过表达或者折叠太快造成的。由于即使是对旨在高产率的细胞间质提取物纯化也会引入污染，所以疏水亲和层析（ HIC ) 被用来将蛋白质的自然形态与那些疏水性极高的未加工完全
的蛋白质形态分离开来（见 16.3.8.4)。
细胞质表达的 β-内酰胺酶变体 wt-clone-cyt 和 FL-S3/6-cyt 用苯基硼酸盐亲和柱和 IMAC 进行纯化。可用离子交换柱进一步纯化（见 16.3.8.5) 。
3.8.1 蛋白质表达和细胞破碎
( 1 ) 将质粒转化到合适的表达菌株（如 BL21)
( 2 ) 从甘油菌挑菌到 2YT/Cm 培养液中，在 28°C 培养 16~18 h ( 见注8 ) 。
( 3 ) 用过夜菌扩培 4 个 1L-2YT/Cm 培养液，起初 OD600 为 0.15，在 24°C 培养 N△5 克隆，在 25~30°C 培养其他克隆（见注 9 )。
( 4 ) OD600 为 0.7 时，用 0.5 mmol/L IPTG 诱导细胞。诱导 40 min 后，加入 100 μg/ml 氨苄来筛选表达内酰胺酶的细胞。
( 5 ) 诱导 4~5 h 后（OD600 为 4~5)，用 GS-3 转子收菌，在 -80°C 冻存。
( 6 ) 为了纯化，将菌（1 L 表达菌液）悬浮在悬浮缓冲液（见注 10 ) 中，加入 200 U 的 benzonase 酶。
( 7 ) 在 97MPa ( 约 14000 psi) 下反复循环 6 次破碎预冷细胞，要一直将样品放在冰上。
( 8 ) 将上清液用 SS-34 转子离心，41000 g，离心 40 min。用 0.45 μm 磺酸多醚注射过滤器过滤上清液。
3.8.2 苯硼酸亲和层析柱
( 1 ) 将 2 ml 苯硼酸盐柱用悬浮缓冲液悬浮，将 16.3.8.1 步骤（8 ) 中得到的上清液上样到亲和柱中，用悬浮缓冲液冲洗直到 280 mn 的吸收达到基线。
( 2 ) 用硼酸缓冲液洗脱 β-内酰胺酶突变体。
( 3 ) 用 12.5% 的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS - PAGE) 来鉴定蛋白质纯度，用考马斯亮蓝染色。
3.8.3 金属亲和柱
( 1 ) 用含 5 mmol/L 咪唑或不含咪唑的磷酸缓冲液平衡 4 ml Ni-NTA 柱子，然后将 16.3.8.2 步骤（2 ) 的样品上柱。
( 2 ) 用含咪唑分别为（5%、10%、16% 和 100% ) 的梯度缓冲液洗脱样品。
( 3 ) 用 12.5% 的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE) 来鉴定蛋白质纯度，用考马斯亮蓝染色。
( 4 ) 为了进一步纯化，在含有 1 mmol/L EDTA 的 1 L 磷酸缓冲液中透析纯化的蛋白质（约 8 h)，重复 3 次。
3.8.4 疏水作用色谱法
( 1 ) 用 1 mol/L (NH4)2SO4 平衡 1 ml 苯基硼酸盐柱。
( 2 ) 将 16.3.8.3 步骤（2 ) 或 16.3.8.2 步骤（2 ) 得到的样品加入硫酸氨到终浓度为 1 mol/L (NH4)2SO4 (见注 11)，离心（10 min；27000 g；4°C；SSr-34 转子）并过滤（ 0.45 μm 过滤器）用以制备澄清样品。
( 3 ) 将样品上样到 HIC 柱子上，用 30 ml 含 0~100% 0.5X 磷酸的线性梯度缓冲液冲洗。疏水越强的部分与柱子结合越紧密。
( 4 ) 如果是苯基硼酸盐亲和层析后直接上 HIC 柱子，样品需要进一步用 IMAC 来纯化（见 16.3.8.3)。
3.8.5 离子交换层析
( 1 ) 将 16.3.8.3 步骤 (2) 中得到的样品在 1~1.5 L Tris-HCl 缓冲液中透析 3~4 次。
( 2 ) 用 Tris-HCl 缓冲液平衡 Mono Q 离子交换柱并上样。
( 3 ) 用 30 ml 0~100% Tris-HCl-NaCl 线性梯度 0~100% 缓冲液洗脱。
( 4 ) 将洗脱得到的样品用节 16.3.8.3 步骤（4 ) 所述方法透析。
所有突变体的氨基酸组成由电喷雾质谱法分析得以证实其符合计算质量的偏差范围。酶按照节 16.3.8.3 步骤（4 ) 所述方法透析，并在纯化一周内进行鉴定。在用之前，酶液需要用离心方法（30 min；15000 g；10°C ) 澄清，蛋白质浓度由在 280 nm 处的吸收光谱测定（见注 12)。
3.9 酶活反应
β-内酰胺酶突变体酶活反应参数是根据发色底物头孢硝噻吩在 486 nm 的光谱来测定的。
( 1 ) 在 980 μl 头孢硝噻吩溶液中加入 20 μl 酶的稀释液，混合均匀后立即在 486 nm 处测定在大约 1 min 内的吸收值的变化（见注 13)。对于起始缺失突变，我们采用的酶的终浓度为 2.5 nmol/L，对于其他变体则为 0.5 nmol/L。
( 2 ) 上述测定过程被重复至少两次并计算标准偏差。
动力学常数是在 25°C 下，在含 0.5% 二甲基亚砜的 50 mmol/L 的磷酸钾缓冲液 ( pH 7.0 ) 中，以 β-内酰胺化合物头孢硝噻吩为底物测定的。
3.9.1 米氏常数的测定及转化率的计算
( 1 ) 为了测定米氏常数（KM )，反应初速率是在底物浓度为 10~500 μmol/L 时，用 2.7~5.9 nmol/L 的 N△5 或 0.5 nmol/L 其他变体来测量完成的。
( 2 ) 将数据输入到米氏方程，如用程序 SigmaPlot (SPSS) 提供的 MarquardtLevenberg 运算法来得到。
N△5 的 KM 值与野生型相比没有变化，但是转化率 K 降低了 6 倍，表明活性位点的构成对底物的结合是充分的，但并不能使有效的催化反应发生（表 16.2 )。
3.9.2 热活性描述及半衰期
为了检测和比较对温度依赖的活性和热诱导失活的动力学参数，进行了热活性筛选。我们测定了在 25~70°C 温度范围提高温度时反应的转化率（图 16.6)。
( 1 ) 为了检测热活性，配制 292 nmol/L 的 N△5 突变体溶液及 25 nmol/L 的其他突变体溶液，并分装成 3 等份。
( 2 ) 将第一等份在已给定温度下（25~70°C ) 的水浴中放置 5 min。其余两等份仍在冰上保存。
( 3 ) 在检测之前，轻微的将样品混匀。
( 4 ) 将 20 μl 样品加入到 980 μl 提前在反应温度下预热的头孢硝噻吩溶液中，反应初速度在 5〜25 s 由加热的光谱仪测得。
( 5 ) 将第二等份在相应的温度下预热 30s，然后按照步骤 （3 ) 和（4 ) 所述测酶活。
( 6 ) 把第三等份在冰上放置 10 min 后测酶活。
( 7 ) 将上述步骤在不同温度下进行重复。
野生型的热活性主要依赖于预热处理（图 16.6A )。在冰上放置或预热 30 s 的酶，其反应的最优温度是 40°C。然而，当酶预热 5 min 后，其最优反应温度降至 35°C，这表明温度依赖的去折叠的出现。
N△5 突变体在 25°C ( 所检测的最低温度）下有最高酶反应活性（图 16.6C）。随着温度的升高，酶活迅速降低，当达到 40°C 时，酶活为零。一个详细的在冰上温浴后在 40°C 下测酶活实验表明，酶是在检测过程中被热失活的，而且发生在将酶加入反应液后的仅数秒内（图 16.7A )。随着温度的升高，酶活降低，通过指数衰减公式（见注14)，可算得半衰期在 40°C 下为 7s ( 图 16.7B)。N△5-S3/6 突变体在 0s 和 30s 的热活性与野生型很相似。然而，5 min 预热后的情况则很不一样。与野生型相比，N△5-S3/6 突变体的热活性提高大约 8℃ ( 图 16.6 A 和 F )。
全长的优化突变体 FL-S3/6-cyt ( 图 16.6 E ) 展示了比优化缺失突变体 N△5-S3/6 以及相应的野生型 wt-clone-cyt 更好的热稳定性（图 16.6 B 和 F) 。这些酶的活性在 40°C 以内很相似，而与预热与否关系不大。在温度高于 50°C 时，FL-S 3/6-cy 保持了显著较高的酶反应活性，尤其在延长热压力到预热 5 min 的情况下。在冰上放置的野生型胞质内酰胺酶的最佳催化活性是在 45°C 下，而预热 5 min 后则降到 35°C。与之相比，FL-S 3/6-cyt 的最佳温度（50°C ) 则保持不变。只是温浴后的反应速率有所下降。有意思的是，野生型和胞质野生型内酰胺酶的 N 端氨基酸（Met 取代 AspGly) 的转换影响着酶的稳定性。
对所有截切突变体和全长突变体的 5 min 预热后的热活性的比较（图 16.6F) 阐明了末端截切是怎样在 35〜40°C 使活性减小的。补偿氨基酸后能够使活性得以恢复，甚至提高稳定性。经过再延长优化了的 S 3/6 突变体进一步提高了酶的热稳定性和热活性。
3.10 尿素诱导的去折叠和数据分析
β-内酰胺酶突变体的去折叠是通过荧光分光光度计来检测的。色氨酸固有的最大荧光发射值的红移作为与尿素浓度相关的函数来测定（图 16.8，表 16.3 )。根据三态模型进行数据分析。
( 1 ) 将 300~400 nmol/L 的酶溶液 [ 见 16.3.8.3 ( 4 ) ] 用 0.25~8 mol/L 的尿素在 19°C 下平衡 18~20 h。
( 2 ) 在 20~23°C，记录 320~380 nm 的突光发射被谱。对每个数据点来说，平均扫描 4 次。
( 3 ) 如果需要，则根据溶液（含有变性剂的磷酸缓冲液）背景荧光来校正荧光光谱。
( 4 ) 从荧光强度谱中算出 λmax 值。我们运用了程序 SiigmaPlot ( 见注 15 ) 中的权重功能（tribute weighting) 来完成此计算。
( 5 ) 分析假定得到的合适去折叠模型的数据。
蛋白质的变性（图 16.8，见注 17 ) 与热活性（图 16.6，16.3.9.2 ) 是相吻合的。稳定性最不好的是 N△5 突变体，然后是野生型胞质内酰胺酶。优化的突变体 N△5 -S3/6 和 N△5 -S3/7 在相同的尿素浓度下开始去折叠，被延长的 FL-S3/6 突变体是最后一个去折叠的。
野生型胞质内酰胺酶和 N△5 的去折叠表现了很明显的三态去折叠。FL/S3-6-cyt 突变体数据也表现了很好的三态去折叠。N△5-S3/6 和 N△5-S3/7 突变体数据既可以用二态，也可以用三态去折叠来解释。相比而言，所有的数据都能用三态模型 NIU，式( 1 ) (步骤（6 )，表 16. 3 ) 来解释。这种方法由以前 TEM - 1 β -内酰胺酶去折叠中间态折叠模型支持 [42~44] 。尿素处理后第一次变性的酶显示了降低的活性。从中得到的热力学值可以帮助比较和解释所得的突变体，但需谨慎使用，因为这是在假设的基础上得到的。去掉前 5 个 N 端的氨基酸（主要影响第一过渡态），稳定性被降低 10 kJ/mol，对第二过渡态的影响不大。催化活性的体内优化得到对两个过渡态都有稳定作用的突变体，所得突变体在第一过渡态的稳定性在野生型之下，而第二过渡态的稳定性则在其之上。与 N△5-S3/6 相比，延长的 FL-3/6-cyt 明显稳定了第一阶段（19.6 kJ/mol)，但对第二阶段的影响不大（3.8 kJ/mol)。这与延长补偿截切突变体不受引入突变的干扰的现象是相符合的。与野生型胞质内酰胺酶 wt- clone-cyt 相比，FL_S3/6-cyt 的稳定性在第一过渡态增加了 15 kJ/mol，在第二次过渡增加了 11.4 kJ/mol。需要注意的是优化的突变体与野生型相比在更高的尿素浓度下才会变性，证实了在热活性实验中观察到的稳定性排序。
3.1 β-内酰胺酶模型系统
为了说明截切- 优化-再延长可以用来提高蛋白质的热稳定性，内酰胺酶被选作模型系统（图 16.1A )。作为一个临床发病机制相关的研究因子和重要的抗体，它所属的家族已被广泛研究，多个晶体结构已解析。许多对该酶的突变已被用于更好地研究和解释结构-功能相关性以及理性设计截切片段。此外，稳定的 β-内酰胺酶还被用于癌症治疗的潜在药物的活性研究，以便得到潜在的药物前体化合物 [ 27，28 ] 。
β-内酰胺酶的 A 家族（EC 3.5.2.6 ) 是细菌胞质酶，其氨基酸序列多样化，稳定性不同，但其三维结构很相似。尽管 β-内酰胺酶的 A 家族的肽主链在核心区能很好地重叠在一起，但在两个末端并没有很好的重叠性。末端结构的不同也与氨基酸长度和氨基酸组成相符合，让这类酶适合于研究序列同源和功能的相关重要性。
3.2 设计末端截切
缺失突变体的正确设计很重要：如果末端截切的过多，由于结构稳定性不够和错误折叠，其得到的截切突变体将没有功能；同样，如果截切的不够多，很有可能得不到期望的表型，选择压力将无法选择出稳定的结构。
如果目标蛋白的结构已被解析，可用 Protein Data Bank (PDB；http : //www.pdb.org/)，SWISSPROT ( http ： //www. expasy. org/sprot/和 http : //www.ebi. ac.uk/swissprot) 以及 SCOP ( http : //scop. mrc-lmb. cam . ac . uk/ scop/ ) 等数据库以及结构分析工具，如分子模型程序 WHATIF (http : //swift cmbi.
kuru nl/WIWWWI) 和 CE 运算法（http : //cl. sdsc . edu /ce . html) ，来进行结构比较和分析。另外，接触图可用作识别可能的非重要和重要的相互作用，这些在设计过程也很重要。如果没有高分辨结构，可用其他的数据 库（如 HSSP) 和 SWISS MODEL 同源模型服务器（http : //swissmodel. expasy. org) , 或者用一个或两个氨
基酸逐切来决定最大截切数。
在该研究中，根据以前的 β-内酰胺酶的突变体研究 [29] 而设计 4 个截切突变体，对 β-内酰胺酶的 A 家族进行结构同源序列比对，用 CE 运算法 [ 30 ] 和 SWIS& PDB 浏览器 [31] (http : //ww w. expasy. org/spdbv) ( 图 16.1B 和图 16.1C) 来分析结构。截切的突变体试图在生理温度下引入结构干扰而不会使蛋白质完全没有功能。N 端前 3 个氨基酸（ His、Pro 和 Glu) 有很高的温度因子（高达 23.8A，平均 13.1A )和溶剂可接触性（PDB 号1btl )，当去掉前 3 个氨基酸得到的突变体 N△3 对蛋白质稳定性的影响比较小。N△5 突变体去掉临近的苏氨酸和亮氨酸，其中苏氨酸被完全掩盖并与 C 端的 Ser285 氨基酸形成氢键。在 C 端，只有 1 个和 3 个氨基酸被去掉 （突变体 C△1 和 C△3 )，因为以前的研究表明末端酪氨酸是关键的氨基酸 [32] 。
3. 载体质粒的设计
载体质粒被设计为当野生型 β-内酰胺酶或截切的突变体与用于细胞间质定位的 N 端 pelB 信号序列融合表达。一 个短的天冬氨酸-甘氨酸的链接被引入用来确保 N 端不同的突变体同等的处理效率。最后，C 端连接 His-tag 可用于固定金属离子亲和柱来纯化，甚至能够纯化非野生型的 β-内酰胺酶变体（图 16.2A)。
载体构建步骤如下：
( 1 ) TEM-1β-内酰胺酶截切突变体 NA3、N△5 和 C△1 及 C△3 是由 pUC 衍生的 TEM-1 基因扩增而来，分别用其正向和反向引物。正向引物含 5' Sfi I 酶切位点，还包含 pelB 信号肽链的 C 端编码序列和 TEM-1 截切突变体的 N 端修饰（截切）序列。在基因的 3' 端，包含反向序列编码改造的 TEM-1 的 C 端序列、1 个短的序列（2 个甘氨酸残基）、5 个 His-tag、2 个终止密码子和 Hind lll 酶切位点。
( 2 ) 其 PCR 产物由 Sfi I/Hind III 双酶切、纯化，然后克隆到 pKMENGRbla (由 K.M.M. 提供）载体中，pKMENGRbla 是由表达载体 pKA400 [ 26 ] 改造而来，含有 1 个氯霉素抗性基因。
得到的质粒（pKJE_Bla—NA/CA 系列）在 lac 操纵子下表达了各种 TEM-1 突变体基因。尽管质粒上的 lacI 有组成型表达，强的 T7g10 Shine-Dalgarno 序列 [ 35 ] 有很高的表达水平，因此所有选择步骤在极端条件下进行，并未过表达。
3.4 末端截切对酶活性的影响
为了检测末端截切对酶活性的影响，在氨苄抗性递增的固体培养基和液体培养基中测其生长速度。通常，在固体板上的筛选比液体状态下更为苛刻。通过本底表达及 IPTG 诱导表达以及在不同温度下的诱导来观察体系的不同。
( 1 ) 如果有需要，用标准方法转化 BL21 细胞涂在 LB/Cm 板上。
( 2 ) 从甘油菌或者转化的过夜（16 h) 培养的 LB/Cm 板上 [ 步骤（1 ) ] 挑取单克隆。
( 3 ) 将过夜培养的菌，在新培养基中稀释至 OD600 为 0.1，并将其培养至 OD600 为 1 ( 见注 1)。
( 4 ) 将预培养的菌液 [ 步骤（3 ) ] 涂在含 IPTG 与不含 IPTG 的不同浓度的氨苄抗性板上。被涂的菌量可估量为 2.5X108 个细胞/ml，1 个 OD600。
( 5 ) 在液体 LB/Cm 培养基中加入步骤（3 ) 的菌液，在含 IPTG 与不含 IPTG 的不同浓度的氨苄培养基中培养。
( 6 ) 生长速率 [ 步骤（4 ) 和（5 ) ] 可以在不同温度下重复。
在不诱导情况下，于固体板上 37°C 培养，当氨苄抗性浓度从 0 μg/ml 增加到 50 μg/ml 时，所有截切突变体的克隆数急剧减少（图 16.2B) 。在连续培养 40 h 后突变体 N△5 和 C△3 没有长出克隆，说明了末端氨基酸的重要性。当 25°C 诱导时，N△5 能够在高达 50 μg/ml 的氨苄固体培养基中生长，在 37°C 液体培养基中在合适的供氧情况下仍能生长。这说明两个截切突变体都能干扰蛋白质结构，但同时可以折叠成有活性的结构。N△5 突变体比 C△3 对抗生素的容忍性更小，因此更适合于下一步的优化。
3.5 DNA 混编和随机突变
逆转由末端截切或删除突变造成的结构干扰的关键优化步骤是在遗传水平上建立高度可变的突变库。随机突变与 DNA 重组的结合能够满足这样的突变需求。
DNA 混编 [ 15，16 ] 是在试管里进行 DNA 重组的广泛应用的方法。由 DNA 混编方法将不同源的基因混杂在一起是定向进化中的关键步骤，其主要特点简述如下：在全基因上进行随机点突变后，主要是由易错 PCR ( 见 16.3.7 ) 引入突变得到的突变库可用来 DNA 片段化，从而得到小的、略微不同的、可相互交换的、长度为 50~200 个碱基对的 DNA 片段。将一个或多个核苷酸不同的同源序列交迭并用 PCR 重新扩增成长片
段，起初用低温退火来确保最小的片段也能够进行 PCR。随着循环次数的增加，将退火温度逐步提髙来选择长的交迭片段。最后，用基因两侧的引物合成全长的基因，并引入合适的酶切位点进行下一步的克隆。
以下内容介绍用易错 PCR 和 DNA 混编来创建有足够复杂度、多样化的突变库。值得注意的是，这里介绍的步骤只针对我们的系统，随着目标基因的长度和组成需要有所改变。需要考虑在易错 PCR 引进突变之前反应的覆盖率，第一次随机突变，第二次组合是不能用来决定混编过程中的错误率的（见注 2 )。
( 1 ) 得到足够量（5~10 μg）的目标基因，可用目标基因两端的同源序列 PCR 或者用限制性内切核酸酶基因末端剪切。如果用 PCR 方法，应该用 Taq DNA 聚合酶来合成产物。在我们的例子中，我们以 pKJE_Bla_N△5 为模板，用引物 Pr_sfi_pelB_DG_ shuffl 和 Pr_GG_his5 _ hind_shuffl 扩增截切的 β-内酰胺酶。
( 2 ) 将 4~5 μg 的目标基因用 0.2 U 的 DNase l 在 50 μl DNaSe I 的酶切体系中，于室温（25°C) 下酶切 12 min。
( 3 ) 加入 4 μl 的 EDTA 溶液终止内切酶反应，并在冰上放置。
( 4 ) 将得到的 DNA 片段在 2% 的琼脂胶上分析并回收长度为 50~150 bp 的 DNA 片段。
( 5 ) 用 Qiaex II 胶回收试剂盒回收 DNA 片段（见注 3)。
( 6 ) 在 50 μl 体系中，加入约 100~300 μg 的纯化的片段用来作引物延伸 PCR ( 见注 4)。反应混合物包括 2.5 U DNA 聚合酶、0.4 mmol/L dNTP 2 mmol/L MgCl2。在 PCR 仪（Eppendorf) 中，PCR 反应用以下程序进行：94°C 3min；94°C 1 min ( 变性），（ 45 + 0.3 )°C 每个循环 1 min (退火），72°C 1 min (延伸）（10 个循环）；最后一个循环后 72°C 5 min；94°C 1 min，（50+0.4)°C 每个循环 1 min，72°C 1 min (15 个循环）；最后一个循环后 72°C 5 min；94°C 1 min，（56+0.5)°C 每个循环 1 min，72°C 1 min (10 个循环）；最后一
个循环后 72°C 5 min；94°C 1 min， ( 61 + 0.5 )°C 每个循环 2 min，72°C 2 min (10 个循环）；最后一个循环后 72°C 5 min。另外，一个简单程序，如 94°C 3 min，35 个循环：92°C 30s，(30 + 1 )°C 每个循环 1 min ，72°C 1 min + 4s/循环，最后一个循环后 72°C 5 min。
( 7 ) 扩增 1/5 体积的重叠的 PCR 反应物（不需要纯化）来扩增全长基因，并加入合适的酶切位点以便下一步克隆。这步可在易错倾向条件下进行，以便扩增突变库的多样化。除了用 Taq DNA 聚合酶延长外，扩增反应的突变率可通过 7 mmol/L MgCl2、0.5 mmol/L MnCl2 的加入而提高( 见注5)。在我们的例子中，我们用引物 Pr_sfi_
pelB_DG_shuffl 和 Pr_GG_his5_hind_shuffl，每条引物的浓度是 0.5 μmol/L。反应混合物包括 7 mmol/L MgCl2、0.5 mmol/L MnCl2、0.4 mmol/L dNTP 和 2.5U Tag。所用的程序是 94°C 3 min，25 个循环：94°C 1 min , 68°C 1 min，72°C 1 min，最后一个循环后 72°C 7 min。
( 8 ) 用 GFX PCR DNA 和切胶回收试剂盒来纯化 PCR 产物，用合适的酶酶切产物，克隆到表达载体中。用16.3.6 所述方法进行转化。
我们进行了 3 个循环的定向进化（S1~S3)，用 DNA 混编和随机突变并结合体内筛选过程。所得到的克隆被收集，作为下一步进化的模板。在定向进化的最后一个循环中，DNA 混编后的易错 PCR 被标准的 PCR 程序取代，防止在重组的克隆中产生有害突变。
16.3.6 转化及在体内筛选突变库
( 1 ) 把质粒突变库，用丁醇沉淀。用 10~20 μl 连接混合物，加入双倍量的去离子水使体积达到 50 μl。加入 500 μl 丁醇在室温离心 2000 g，30 min。去掉上清液，在室温晾干，加入 10~20 μl 的水。
( 2 ) 将沉淀后的 DNA 加入到 100 μl 电转感受态 E.coli XL-1 蓝细胞中。1.7 kV，200Ω，25 μF。转化完后立即加入 900 μl 的 2YT 培养基和 1/100 体积的转化盐储液。
( 3 ) 将悬浮的细胞加入 10 ml 玻璃试管中，在 37°C 培养 60~70 min。
( 4 ) 通过将转化产物逐步稀释涂在 LB/Cm 板上来检测转化效率。
( 5 ) 用另一管转化的细胞涂在不同浓度的氨苄抗性 LB/Cm 板上来检测筛选压力( 见注 6)。选择在最高氨苄浓度下长出来的突变体来进行下一步实验。
( 6 ) 作为筛选，把转化的细胞涂在不同浓度的氨苄抗性 LB/Cm 板上 [ 由步骤（5 )得到的浓度 ] ( 见注 6 )。我们用的氨苄在第一到第三次筛选的浓度分别为 20 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml。第一次的筛选是在液体培养基中进行，后两次筛选是在固体培养基上。
突变体 N△5 经过 3 个循环的定向进化（包括随机突变和 DNA 混编）（见 16.3.5)，被损功能得以恢复。在这 3 个循环中得到 19X103 个，147X103 个和 260X103 个的克隆，分别在 20 μg/ml，100 μg/ml 和 200 μg/ml 氨苄抗性板上生长 [ 步骤（6 )]，得到 3600~7000个克隆。
表 16.1 总结了所有在 3 个混编循环（S1~S3 ) 的定向进化中得到的克隆的测序结果。另外，表 16.1 还包括了每个野生型残基的相对溶剂可接触性和平均侧链原子温度因子（由 PDB 1btl )[ 37] 。其中在第二个循环后的 5 个突变体有两个突变，M182T 和 T265M ( 根据 Ambler et al. 命名，这两个突变在第一次循环后已经存在。
经过最后优化步骤，收集突变库，在不用 IPTG 诱导的情况下，决定最大氨苄抗性浓度，见 16.3.4 ( 图 16.3)。能长出显著数目的克隆数的抗性是 700 μg/ml，经过 40 h 的培养，克隆可在含 1000 μg/ml 的抗性上生长。相比，野生型只能在 500 μg/ml 的抗性上生长。从含 800 μg/ml 和 1000 μg/ml 的抗性板上挑取 26 个克隆，并测序。26 个克隆属于 15 个不同的突变体（表 16.1)。所有的克隆有两个共同的突变位点，M 182T 和 A224V。以
前的研究表明 M182T 突变体能够互补折叠缺陷 [39] 和稳定性缺失 [ 29，40 ]。突变体 A224V 在第三次循环中提高选择压力。这个突变体曾经被提到过，但并没有实验数据证实 [41]。
两个突变体离截切的位点有 17A 的距离，表明是由截切引起的结构干扰的独立互补。图 16.4 是对 TEM- 1β-内酰胺酶最常用的一些突变残基。通常，在单独优化的突变体中矢变在在在整个结构中分布，而不是局部聚集在一起。
3.7 全长突变体的构建
优化的 N△5-S3/6 被再延长来研究突变对被截切后的不稳定蛋白质的互补作用。根据图 16.2A，被截切的氨基酸重新被加上，从而得到全长基因——被命名为 FL-S3/6 的克隆。这个突变体定位在细胞间质，在 E.coli XL-1 Blue 中表达来检测体内功能。让人意外的是，在含氯霉素和 100 μg/ml 氨苄板上于 37°C 20 h 生长的克隆数目只有不含氨苄的对照板上的 50%。这和 N△5-S 3/6 在两个板上得到相同数目克隆成鲜明对比。为了研究蛋白质
功能和蛋白质定位，对 FL-S 3/6 和 N△5 - S3/6 的细胞粗提液做酶活反应。没有看到对发色底物头孢硝噻吩的水解反应的区别，说明酶的定位是很重要的。与这些数据相符合的是在 FL- S 3/6 的纯化过程中也能看到信号肽剪切的减少（见 16.3.8)。因此，可在细胞质内表达的 FL- S3/6-cyt 被克隆，该克隆用甲硫氨酸替代了信号肽以及Asp- Gly tag。为了保证在生理条件下正确的对比，与野生型内酰胺酶类似的基因（wt- done-cyt) 也被克隆。
3.8 蛋白质表达及纯化
β-内酰胺酶突变体（野生型间质定位的、野生型胞质定位的、N△5、优化的 N△5-S3/6、N△5- S5/S7 和 FL-S3/6 胞质定位的突变体）在 lac 启动子下于 E.coli 细胞中带 His -tag 融合表达（见 16.3.8.1)。通过两步纯化反应进行纯化，首先用底物相似的亲和层析苯基硼酸盐柱子（见 16.3.8.2 )，再用 IMAC ( 见 16.3.8.3 )。这种纯化步骤非
常适用于 N△5 (图 16. 5 ) 和 N△5- S3/7 突变体的纯化。
对于某些 β-内酰胺酶突变体（野生型、N△5- S3/6、FL-S3/6)，其纯化的蛋白质有很高的污染并呈未加工完全的形态（30%~ 65% ; 见注 7 )，极可能是因为过表达或者折叠太快造成的。由于即使是对旨在高产率的细胞间质提取物纯化也会引入污染，所以疏水亲和层析（ HIC ) 被用来将蛋白质的自然形态与那些疏水性极高的未加工完全
的蛋白质形态分离开来（见 16.3.8.4)。
细胞质表达的 β-内酰胺酶变体 wt-clone-cyt 和 FL-S3/6-cyt 用苯基硼酸盐亲和柱和 IMAC 进行纯化。可用离子交换柱进一步纯化（见 16.3.8.5) 。
3.8.1 蛋白质表达和细胞破碎
( 1 ) 将质粒转化到合适的表达菌株（如 BL21)
( 2 ) 从甘油菌挑菌到 2YT/Cm 培养液中，在 28°C 培养 16~18 h ( 见注8 ) 。
( 3 ) 用过夜菌扩培 4 个 1L-2YT/Cm 培养液，起初 OD600 为 0.15，在 24°C 培养 N△5 克隆，在 25~30°C 培养其他克隆（见注 9 )。
( 4 ) OD600 为 0.7 时，用 0.5 mmol/L IPTG 诱导细胞。诱导 40 min 后，加入 100 μg/ml 氨苄来筛选表达内酰胺酶的细胞。
( 5 ) 诱导 4~5 h 后（OD600 为 4~5)，用 GS-3 转子收菌，在 -80°C 冻存。
( 6 ) 为了纯化，将菌（1 L 表达菌液）悬浮在悬浮缓冲液（见注 10 ) 中，加入 200 U 的 benzonase 酶。
( 7 ) 在 97MPa ( 约 14000 psi) 下反复循环 6 次破碎预冷细胞，要一直将样品放在冰上。
( 8 ) 将上清液用 SS-34 转子离心，41000 g，离心 40 min。用 0.45 μm 磺酸多醚注射过滤器过滤上清液。
3.8.2 苯硼酸亲和层析柱
( 1 ) 将 2 ml 苯硼酸盐柱用悬浮缓冲液悬浮，将 16.3.8.1 步骤（8 ) 中得到的上清液上样到亲和柱中，用悬浮缓冲液冲洗直到 280 mn 的吸收达到基线。
( 2 ) 用硼酸缓冲液洗脱 β-内酰胺酶突变体。
( 3 ) 用 12.5% 的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS - PAGE) 来鉴定蛋白质纯度，用考马斯亮蓝染色。
3.8.3 金属亲和柱
( 1 ) 用含 5 mmol/L 咪唑或不含咪唑的磷酸缓冲液平衡 4 ml Ni-NTA 柱子，然后将 16.3.8.2 步骤（2 ) 的样品上柱。
( 2 ) 用含咪唑分别为（5%、10%、16% 和 100% ) 的梯度缓冲液洗脱样品。
( 3 ) 用 12.5% 的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE) 来鉴定蛋白质纯度，用考马斯亮蓝染色。
( 4 ) 为了进一步纯化，在含有 1 mmol/L EDTA 的 1 L 磷酸缓冲液中透析纯化的蛋白质（约 8 h)，重复 3 次。
3.8.4 疏水作用色谱法
( 1 ) 用 1 mol/L (NH4)2SO4 平衡 1 ml 苯基硼酸盐柱。
( 2 ) 将 16.3.8.3 步骤（2 ) 或 16.3.8.2 步骤（2 ) 得到的样品加入硫酸氨到终浓度为 1 mol/L (NH4)2SO4 (见注 11)，离心（10 min；27000 g；4°C；SSr-34 转子）并过滤（ 0.45 μm 过滤器）用以制备澄清样品。
( 3 ) 将样品上样到 HIC 柱子上，用 30 ml 含 0~100% 0.5X 磷酸的线性梯度缓冲液冲洗。疏水越强的部分与柱子结合越紧密。
( 4 ) 如果是苯基硼酸盐亲和层析后直接上 HIC 柱子，样品需要进一步用 IMAC 来纯化（见 16.3.8.3)。
3.8.5 离子交换层析
( 1 ) 将 16.3.8.3 步骤 (2) 中得到的样品在 1~1.5 L Tris-HCl 缓冲液中透析 3~4 次。
( 2 ) 用 Tris-HCl 缓冲液平衡 Mono Q 离子交换柱并上样。
( 3 ) 用 30 ml 0~100% Tris-HCl-NaCl 线性梯度 0~100% 缓冲液洗脱。
( 4 ) 将洗脱得到的样品用节 16.3.8.3 步骤（4 ) 所述方法透析。
所有突变体的氨基酸组成由电喷雾质谱法分析得以证实其符合计算质量的偏差范围。酶按照节 16.3.8.3 步骤（4 ) 所述方法透析，并在纯化一周内进行鉴定。在用之前，酶液需要用离心方法（30 min；15000 g；10°C ) 澄清，蛋白质浓度由在 280 nm 处的吸收光谱测定（见注 12)。
3.9 酶活反应
β-内酰胺酶突变体酶活反应参数是根据发色底物头孢硝噻吩在 486 nm 的光谱来测定的。
( 1 ) 在 980 μl 头孢硝噻吩溶液中加入 20 μl 酶的稀释液，混合均匀后立即在 486 nm 处测定在大约 1 min 内的吸收值的变化（见注 13)。对于起始缺失突变，我们采用的酶的终浓度为 2.5 nmol/L，对于其他变体则为 0.5 nmol/L。
( 2 ) 上述测定过程被重复至少两次并计算标准偏差。
动力学常数是在 25°C 下，在含 0.5% 二甲基亚砜的 50 mmol/L 的磷酸钾缓冲液 ( pH 7.0 ) 中，以 β-内酰胺化合物头孢硝噻吩为底物测定的。
3.9.1 米氏常数的测定及转化率的计算
( 1 ) 为了测定米氏常数（KM )，反应初速率是在底物浓度为 10~500 μmol/L 时，用 2.7~5.9 nmol/L 的 N△5 或 0.5 nmol/L 其他变体来测量完成的。
( 2 ) 将数据输入到米氏方程，如用程序 SigmaPlot (SPSS) 提供的 MarquardtLevenberg 运算法来得到。
N△5 的 KM 值与野生型相比没有变化，但是转化率 K 降低了 6 倍，表明活性位点的构成对底物的结合是充分的，但并不能使有效的催化反应发生（表 16.2 )。
3.9.2 热活性描述及半衰期
为了检测和比较对温度依赖的活性和热诱导失活的动力学参数，进行了热活性筛选。我们测定了在 25~70°C 温度范围提高温度时反应的转化率（图 16.6)。
( 1 ) 为了检测热活性，配制 292 nmol/L 的 N△5 突变体溶液及 25 nmol/L 的其他突变体溶液，并分装成 3 等份。
( 2 ) 将第一等份在已给定温度下（25~70°C ) 的水浴中放置 5 min。其余两等份仍在冰上保存。
( 3 ) 在检测之前，轻微的将样品混匀。
( 4 ) 将 20 μl 样品加入到 980 μl 提前在反应温度下预热的头孢硝噻吩溶液中，反应初速度在 5〜25 s 由加热的光谱仪测得。
( 5 ) 将第二等份在相应的温度下预热 30s，然后按照步骤 （3 ) 和（4 ) 所述测酶活。
( 6 ) 把第三等份在冰上放置 10 min 后测酶活。
( 7 ) 将上述步骤在不同温度下进行重复。
野生型的热活性主要依赖于预热处理（图 16.6A )。在冰上放置或预热 30 s 的酶，其反应的最优温度是 40°C。然而，当酶预热 5 min 后，其最优反应温度降至 35°C，这表明温度依赖的去折叠的出现。
N△5 突变体在 25°C ( 所检测的最低温度）下有最高酶反应活性（图 16.6C）。随着温度的升高，酶活迅速降低，当达到 40°C 时，酶活为零。一个详细的在冰上温浴后在 40°C 下测酶活实验表明，酶是在检测过程中被热失活的，而且发生在将酶加入反应液后的仅数秒内（图 16.7A )。随着温度的升高，酶活降低，通过指数衰减公式（见注14)，可算得半衰期在 40°C 下为 7s ( 图 16.7B)。N△5-S3/6 突变体在 0s 和 30s 的热活性与野生型很相似。然而，5 min 预热后的情况则很不一样。与野生型相比，N△5-S3/6 突变体的热活性提高大约 8℃ ( 图 16.6 A 和 F )。
全长的优化突变体 FL-S3/6-cyt ( 图 16.6 E ) 展示了比优化缺失突变体 N△5-S3/6 以及相应的野生型 wt-clone-cyt 更好的热稳定性（图 16.6 B 和 F) 。这些酶的活性在 40°C 以内很相似，而与预热与否关系不大。在温度高于 50°C 时，FL-S 3/6-cy 保持了显著较高的酶反应活性，尤其在延长热压力到预热 5 min 的情况下。在冰上放置的野生型胞质内酰胺酶的最佳催化活性是在 45°C 下，而预热 5 min 后则降到 35°C。与之相比，FL-S 3/6-cyt 的最佳温度（50°C ) 则保持不变。只是温浴后的反应速率有所下降。有意思的是，野生型和胞质野生型内酰胺酶的 N 端氨基酸（Met 取代 AspGly) 的转换影响着酶的稳定性。
对所有截切突变体和全长突变体的 5 min 预热后的热活性的比较（图 16.6F) 阐明了末端截切是怎样在 35〜40°C 使活性减小的。补偿氨基酸后能够使活性得以恢复，甚至提高稳定性。经过再延长优化了的 S 3/6 突变体进一步提高了酶的热稳定性和热活性。
3.10 尿素诱导的去折叠和数据分析
β-内酰胺酶突变体的去折叠是通过荧光分光光度计来检测的。色氨酸固有的最大荧光发射值的红移作为与尿素浓度相关的函数来测定（图 16.8，表 16.3 )。根据三态模型进行数据分析。
( 1 ) 将 300~400 nmol/L 的酶溶液 [ 见 16.3.8.3 ( 4 ) ] 用 0.25~8 mol/L 的尿素在 19°C 下平衡 18~20 h。
( 2 ) 在 20~23°C，记录 320~380 nm 的突光发射被谱。对每个数据点来说，平均扫描 4 次。
( 3 ) 如果需要，则根据溶液（含有变性剂的磷酸缓冲液）背景荧光来校正荧光光谱。
( 4 ) 从荧光强度谱中算出 λmax 值。我们运用了程序 SiigmaPlot ( 见注 15 ) 中的权重功能（tribute weighting) 来完成此计算。
( 5 ) 分析假定得到的合适去折叠模型的数据。
蛋白质的变性（图 16.8，见注 17 ) 与热活性（图 16.6，16.3.9.2 ) 是相吻合的。稳定性最不好的是 N△5 突变体，然后是野生型胞质内酰胺酶。优化的突变体 N△5 -S3/6 和 N△5 -S3/7 在相同的尿素浓度下开始去折叠，被延长的 FL-S3/6 突变体是最后一个去折叠的。
野生型胞质内酰胺酶和 N△5 的去折叠表现了很明显的三态去折叠。FL/S3-6-cyt 突变体数据也表现了很好的三态去折叠。N△5-S3/6 和 N△5-S3/7 突变体数据既可以用二态，也可以用三态去折叠来解释。相比而言，所有的数据都能用三态模型 NIU，式( 1 ) (步骤（6 )，表 16. 3 ) 来解释。这种方法由以前 TEM - 1 β -内酰胺酶去折叠中间态折叠模型支持 [42~44] 。尿素处理后第一次变性的酶显示了降低的活性。从中得到的热力学值可以帮助比较和解释所得的突变体，但需谨慎使用，因为这是在假设的基础上得到的。去掉前 5 个 N 端的氨基酸（主要影响第一过渡态），稳定性被降低 10 kJ/mol，对第二过渡态的影响不大。催化活性的体内优化得到对两个过渡态都有稳定作用的突变体，所得突变体在第一过渡态的稳定性在野生型之下，而第二过渡态的稳定性则在其之上。与 N△5-S3/6 相比，延长的 FL-3/6-cyt 明显稳定了第一阶段（19.6 kJ/mol)，但对第二阶段的影响不大（3.8 kJ/mol)。这与延长补偿截切突变体不受引入突变的干扰的现象是相符合的。与野生型胞质内酰胺酶 wt- clone-cyt 相比，FL_S3/6-cyt 的稳定性在第一过渡态增加了 15 kJ/mol，在第二次过渡增加了 11.4 kJ/mol。需要注意的是优化的突变体与野生型相比在更高的尿素浓度下才会变性，证实了在热活性实验中观察到的稳定性排序。
来源：丁香实验
