“光谱仪在生物 /生命科学领域中的应用”问题集锦

9月19日，HORIBA Scientific举办了光谱应用系列在线讲座（1）——“光谱仪在生物/生命科学领域中的应用”。

涉及：荧光光谱、拉曼光谱、SPRi表面等离子体共振成像三大技术，吸引了众多师生的参与。在讲座过程中大家也就自己在学习或工作中遇到的困惑踊跃提问，但由于现场时间有限，有部分问题没来得及作答，现整理后供大家参考。

1：拉曼光谱技术

Q：不同的波长激发，同一物质的拉曼峰会偏移吗？

A：会。对于大部分物质来说，不同的激发波长不会对拉曼位移产生影响，但是有一些特殊的物质如石墨烯的2D峰，是双声子共振二阶拉曼峰，连接声子波矢量和电子能带的双共振过程使得2D峰频率极易受激发光波长影响。

Q：偏移不是与激发波长无关么?

A：有些特殊的振动会受激发波长的影响，可参见文章“Raman Spectroscopy of Carbon Materials:Structural Basis Of Observed Spectra”, Y.Wang, D.C Alsmeyer and R.McCreery, Chem.Matter, 2, 1990.

Q：拉曼成像跟荧光流式有什么区别和特色？

A：两者的基本原理不一样。拉曼不需要对物质进行荧光标记等特殊处理，即可直接获得物质的化学结构信息，通过成像可以获得物质的成分分布、晶型分布、结晶度差异、应力/应变分布等；而荧光流式需要对物质进行荧光标记，不同的物质会特异性地结合不同的荧光标记物，然后利用荧光信号的不同来区分物质。由于拉曼不需要前处理，因而不会破坏样品的原有特征，不存在获得错误信息的风险。

Q：参数是什么样的设备能测出石墨烯？

A：不知道您具体关注什么参数以及希望获得哪些信息，如果只是简单的测个光谱，那要视您的石墨烯基底选择合适的激发波长，比如生长在Cu基底上的石墨烯选择473nm的激光波长会比较好，其它基底的532nm和633nm都可以；

如果您想要获得石墨烯的层数分布，获得微米级别的空间分辨率，那就需要一台空间分辨率比较高的共聚焦拉曼光谱仪。如果您希望通过拉曼区分3层以上的少多层石墨烯，那就需要一台低波数能测到10cm-1左右的拉曼仪器。

Q：有专门针对石墨烯测试的产品吗？

A：HORIBA有不同的拉曼光谱仪，都可以测试石墨烯。关键取决于您的应用需求，不同的需求对光谱仪配置的要求也不同。

Q：可以对一些比较重的样品进行原位成像吗？

A：可以。HORIBA有DuoScan技术，可以不移动样品，而是通过激光光斑的移动来获得成像。

Q：非TERS的显微拉曼光谱仪最好的空间分辨率是多少？激光聚焦对样品温度的影响有多大，可以校正吗？

A：一般激光光斑的尺寸在1μm左右，所以空间分辨率在500nm左右。使用油镜或水镜可提高空间分辨率，好的情况下可以达到200nm。通常我们会选择合适的激光功率测试样品，该激光功率可保证样品不被破坏，也就不会引起样品温度的变化。

Q：SiO2薄膜可以用拉曼光谱检测吗？

A：可以。拉曼还可以获得SiO2的晶型，比如无定型和石英SiO2 的峰有很大差异。如果您关心薄膜的厚度，那可以了解一下椭圆偏振光谱仪和辉光放电光谱仪。

Q：什么叫真共聚焦？

A：真共聚焦是指激发光聚焦在样品点表面，而信号聚焦在针孔上。这一针孔限制仪器在样品表面的聚焦深度，有效防止杂质信号产生的背景噪音干扰，从而降低背景信号的强度。

HORIBA仪器的真共焦设计是在光路上安装完全可以调节的共焦针孔光阑，达到微米级别的纵向分辨率。关于真假共聚焦，也可参阅文献：《拉曼光谱仪的两种共焦显微技术的对比》，肖新民，现代科学仪器，2005.3。

Q：近红外光谱仪能组装成拉曼光谱仪么？

A：不能。这是两种不同的技术。

Q：HORIBA有做SERS晶片吗？

A：有。HORIBA可以提供商业化的SERS晶片。

Q：快速共焦成像得到拉曼谱图一般要采集多少秒？

A：这取决于样品信号的强弱，对于信号强的样品，可快至1ms。

Q：拉曼在做活体单细胞时，功率对细胞也是无损的吗？

A：高功率可能会损坏细胞，HORIBA可提供不同的功率衰减片对激光进行衰减，当功率衰减到一定的程度时，就不会对细胞造成损伤了。

Q：可以用拉曼测试气体，比如汞蒸汽（会混合二氧化碳/氮气）吗?

A：可以。如果您的蒸汽比较稀薄，可能会信号比较弱，可通过对气体进行压缩来提高信号强度。

Q：SiO2薄膜镀是在什么基底上都可以检测出来吗？

A：玻璃的成分也是SiO2，如果您的薄膜长在玻璃上，就难以区分是您的样品信号还是玻璃基底信号。

Q：HORIBA有用于爆炸物危险品检测的手持拉曼光谱仪吗？

A：HORIBA没有手持式，因为手持式拉曼一般只适用于检测信号比较强的样品，对于一些信号弱的爆炸物危险品就难以检测。不过，HORIBA有便携式拉曼光谱仪，可以装在行李箱里拖着走，它的检测灵敏度跟一般的显微拉曼光谱仪差不多，即使是弱信号的样品也能检测出来。

2. 荧光光谱课程

Q：能不能提供一些关于“微区分析的解决方案”的资料？

A：可以到HORIBA官网查找相关应用文献。

Q：温度因素如何考虑？

A：要考虑3种情况。

1、常规的蛋白质分析：需要10-90℃，我们可以提供TE（半导体电制冷控温）以及循环域控温；

2、磷光分析：例如需要得到样品在液氮77K温度下的发光信息，我们可以提供液氮杜瓦瓶装置，可以直接将其放在样品仓内进行荧光或磷光光谱的采集；

3、发光材料分析：需要得到更低或变温实验，我们可以采取耦合低温装置（液氮、液氦）方案，将低温装置放到我们的样品仓中进行低温测试。

Q：能否说一下荧光在DNA检测方面的发展趋势？

A：建议您进入文献数据库，或谷歌学术查找综述类文章。

3、SPR光谱课程

Q：SPR不是以金膜上物质的折射率改变来检测峰位置的偏移来确定含量，这里的质量本质上也是改变折射率？

A：改变金膜的折射率变化；

Q：SPR做DNA&蛋白质的特异性筛选，后续能否做到碱基对精准？或者说抓到后，到最后怎么测序？

A：可以。最后可进行测序仪分析。建议您与我们的工程师联系，告知您的具体应用需求

Q：SPR可以和拉曼联用吗？如何耦合呢？

A：可以。通过拉曼光纤探头耦合SPRi，能同时获得SPRi-Biochip的拉曼和SPRi信号。

Q：请介绍下SPR测量质量的原理？热力学参数是如何测量的？

A：SPR是一种物理光学现象，当金属薄膜表面质量发生改变时，会引起表面折射率产生变化，通过测量这种变化，可得到分子作用动力学及浓度等信息，从而了解分子之间的相互作用。

在一定温度下，获得动力学和亲和力参数，即可通过计算获得热力学参数的；

Q：现在SPRi和MS有联用吗？

A：有。我们有客户在进行这方面的研究，而且现在也有很多相关文献，您可以进入Science搜索。