盘绕螺旋结构的设计和优化技巧
丁香园
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1. 介绍
盘绕螺旋是常见的结构，据估计在大多数基因组中占到编码残基的 3%~5% [1] 。它由 25 个 α 螺旋组成，通常以左旋这种特殊方式相互缠绕，形成一个超螺旋。一般规则的 α 螺旋形成一圈螺旋需要 3.6 个残基，而左旋盘绕螺旋则只需 3.5。这意味着每两圈螺旋含有七氨基酸的重复 [2，3] 。最常见的盘绕螺旋类型是平行（即两个螺旋并排地从 N 端盘绕到 C 端）二聚和左旋的。在这一类型中，每个螺旋的周期都是 7。在蛋白质内的任何位置都可能有 2 ( 在设计的盘绕螺旋中；参考文献 [ 4 ] )~200 个这样的重复 [ 5 ]。在这个重复中，一个螺旋的残基标记为（a - b- c - d - e - f- g ) n，另一个则标记为（a'-b'- c'- d'- e'-f '- g'）。 ( 图 3.1)。在这个模型中，a 和 b 通常是位于两个螺旋的交接处的非极性的核心残基，相反，e 和 g 是部分地溶液暴露的极性 “边缘” 残基，通过静电相互作用，它们使得两个螺旋的相互作用有特异性。最后，剩下的 3 个残基（b、c 和 f ) 是典型的亲水残基并暴露于溶液中。盘绕螺旋结构连同它的七元周期性在表观上的简单性，使它得到了大量研究。引人注目的是，两个螺旋间的相互作用仍然是高度特异性的过程。正是结构周期表面的简单性与高特异性和强亲和力相结合，使这个普遍存在的蛋白质结构类型这样地引人注目。
在天然的和设计的含 2 个 或 3 个螺旋的标准盘绕螺旋中，界面边缘的互补电荷可缓解不同螺旋间的排斥这就是以促进杂寡聚的形成。我们把这称为肽拉链（PV ) 假定 [8] 。这是在参考了 Kim 及其合作者设计的、他们称之为 “ Peptide Velcro” 的、专性杂二聚盘绕螺旋 [9] 之后提出的（Velcro 是尼龙的商品名，由两个法文单词 “ velour” —— 钩和 “crochet”——圈连成；是由钩和圈组成的带子，轻压可以将两条带子连在一起，撕拉又可以将它们分开——译者注）。除 e 和 g 位外，这两条多肽是相同的。在 e 和 g 位，一条链是 Lys，而另一条是 Glu ( 见注 2 )。像其他类似的多肽对一样，这一对多肽在试管中形成稳定的杂二聚体。最近的一项研究通过直接将理性设计和基因选择技术的结果进行比较，检验了 PV 假定 [8]。与 PV 假定相反（但与许多天然盘绕螺旋的序列性质相符），选择出的多肽对，既没有极大化相互吸引的 g/e' 电荷对，也没有消除相互排斥的 g/e' 电荷对（见 3.2.2.3)。许多因素可以影响 g/e' 带电残基的贡献。整体静电势——包括分子间的和分子内的相互作用，起主要的作用。与核心残基的相互作用，如有利的堆积或立体的冲撞，都被用来模拟 g/e' 相互作用。序列范围内的其他效应，来自于局部的螺旋柔性或来自于与 b、c 或 f 残基的相互作用，都有可能发生。对盘绕螺旋结构的检查提示，e 和 g 位在结构上有区别，这些区别可能会以不同的方式容纳不同的电荷对。
在这里，我们对每个氨基酸在维持 α 螺旋结构合促进形成符合期望的寡聚态和左旋取向的盘绕螺旋结构中所起的重要作用做一个概述。本章的目的是强调在设计或优化这类盘绕螺旋时需要考虑的重点。这一章因而应该看作是一个“指南”，为便于盘绕螺旋的设计，解释得到期望的寡聚态（见 3.2.1)、特异性（见 3.2.2) 、螺旋取向（ 见 3.2.3 ) 和稳定性（见 3.2.4 ) 所需要的最重要的操作。我们讨论在 a 和 b 疏水核心位以 及 e 和 g 静电边缘位的氨基酸残基共同的影响，以及这些残基与 b 位、c 位和 f 位残基 一起在保持 α 螺旋倾向、螺旋可溶性和二聚体整体稳定性上的作用。另外，也要讨论 N 端加帽和 C 端加帽的可能性。除非在正文中特殊地声明，我们都以二聚平行盘绕螺旋模体为参考态。我们还讨论了最近一篇述评中所述的盘绕螺旋在一般意义上的稳定性和特异性 [10] 。
对螺旋结合规律的理解使得对这些螺旋的新探索成为可能 [11] 。例如，通过将抗体 Fv 片段与螺旋融合产生被螺旋稳定的抗体；或将抗体 scFv 片段与螺旋融合以产生微小抗体（miniantibody) [13]；或作为热感应器（如连接了绿色突光蛋白的 TlpA，用突光变化作为读出信号监测 TlpA 的结构随着温度变化）。这使得由盘绕螺旋二聚体形成参与的信号传导过程的测定成为可能 [ 14 ]。
3.3 注
1. GCN4-p1 的序列：Ac-R MKQLEDK VEELLSK NYHLENE VARLKKL VGER-COOH。在 Harbmy 等的研究中 [ 16，17] 突变过的 a 和 d 残基用黑体显示。经受过许多突变研究的核心 Asn 16 标有下画线。
2. 设计的杂二聚肽拉链 [9] 为合成多肽：Acid-p1 ( At-AQLEKE LQALEKE NAQLEWE LQALEKE LAQ -NH2 ) 和 Base-p1 ( Ac-AQLKKK LQALKKK NAQLKWK LQALKKK LAQ-NH2) 。在此和随后的注中，序列中单个七元重复用空格分开。核心 Asn 残基，如已说过的经受过突变，见 3.2.1.2 (4)，标有下画线。
3. 两个半胱氨酸二硫键联结的多肽的序列 2H (Ac-KCEALEGK LEALEG KLEAAEG K LEALEGK LEALEG ~N H2 和 Ac-ELAELKG E LAELKG E AAELKG ELAELKG E LAEC KG -NH2) 和 4H （ALEG K LEALEG -N H 2 m Ac-ELAELKG E LAELKG E L AEAKG E LAELKG E L A E C K O NH 2)。为显示 2H 和 4H 中两条链间的共价连接点，半胱氨酸用黑体示出，而规定寡聚态的 Ala 用下画线示出。
4. 鼠 COMP 蛋白的盘绕螺旋结构域（氨基酸 27~72) 序列（21 )：RE L Q E T N A A LQ D VR EL LRQQ VKE IT F L K N T VMECDACG。在鼠 COMP 的表达片段中，Gly 27 被 Met 所取代。
5. 研究基于多肽 A1 ( M R G SH H H H H H G SM A SGDLENE YAQLERE VRSLEDE AA ELE Q K VSRLKNE IE D L A E I GDLNNTSGIRRPAA K L N ) 。三氟亮氨酸和六氟亮氨酸的掺入以取代亮氨酸（黑体），通过在没有亮氨酸的培养液中加入三氟亮氨酸或六氟亮氨酸，用基因表达 [ 22，23] 。
6. 如注 2 所说明的，Kretsinger 等的研究系基于 GCN4-p1 多肽。他们将 C 端酰胺化，并报道了在第一个七元重复的 Asp 和 Lys 间插入 Set 的序列 [ 24 ] 。因为这一插入会移动七元重复，我们可以假定这是图中的一个错误。有下画线的 Asn ( 见注 2 ) 被变为 Asp 二氨基庚二酸（diaminopropionic acid) 及其一、二和三甲基化类似物。
7. 本节中，杂二聚体系从两个设计的盘绕螺旋库中选出：LibA : V A Q L # E #V K T L # A # § Y E L # S # V Q R L # E # V A Q L fq L ib B ： V D E L # A # V D Q L # D # Y A L # T # V A Q L # K # V E K L，其中，# 表示 E 、Q 、K 和 R 的等摩尔混合， § 表示 V 和 N 的等摩尔混合[ 31] 。核心 a 位和 d 位的序列来自于GCN4 (见注 2 )，而 b 位、c 位和 f 位的序列（有下画线）来自 c-Jun ( R LEEK VILKQ NLA T AN M LR EQ VA Q L ) 和 c-Fos ( TTLQ E TLE Q E K Y A L Q T E IA N L L K E KSL) 的盘绕螺旋结构域。
8. GCN4-pVL 变体的序列是 ArR MKQ LED K VEELSK YH LEN E V A R L K K L V G E R ，其中 a 位和 d 位用黑体显示。用 # 表示的 12 位（ d ) 或者是 Leu，或者是一个极性残基（N 、Q 、S 或 T )，用 § 表示的 16 位 （ a ) 或者是 Val，或者是一个极性残基 [ 25 ] 。
9. 两项研究都使用二硫键桥接的盘绕螺旋。此螺旋基于序列 VG ALKKE，做了一些修正以避免链内和链间与替换位点（X )的电荷-电荷相互作用，并调节整体电荷。其序列分别是 Ac-CGGE VG ALKAQ VGALQAQ XGALQKE VGALKKE VGALKK- NH2 [ 33] 和 ACGGE VGALKAE VG ALKAQ IG AX-Q KQ IG ALQ KE VGALKK- NH2 [32]。
10. Ji 等使用了记为 N36 ( L 6 ) C 34 的猿猴免疫缺陷病毒 gp41 核心的重组模型， 其中的氨基端螺旋（N36 ) 构成中心的三聚盘绕螺旋，而羧基端螺旋（C34 ) 以反平行 的取向堆积到此盘绕螺旋三聚体的疏水凹槽中。N36 和 C34 被一短联结子分开（L6；参考文献 [ 34 ] ) 。在 N36 结构域中，极性核心残基（黑体 ）突变为 lie : AG IVQ Q QQQ LLD V VKR Q Q EL LR LTVW G T K N L Q T R V T 。产生不溶聚集的 Q→I 突变用下画线标出。
11. 父辈多肽 Lac21 的序列是 Ac- ML A D S LM Q LAR Q VLESA- NH2 (见注 28)。有下画线的残基被突变为 E 或 K，以分别产生形成杂四聚的多肽 Lac21E 和 Lac21K [ 35 ] 。
12. APC-55 的序列：AAAS Y D Q L L K Q V E A L K M E N S N L R Q E L E D N S N H LTK L ET E ASN M KEV LKQLQGSI 和 anti-APC p1 的序列：MAA GDQLK V EA L YE NSNLRKL EDHL TKLTE IS N A K K M LKQ LYASI [36]。antiAPCp1 与 APC-55 相比较的核心变化用黑体标出；e 位 和 g 位的改变用下画线标示；为 增加稳定性、增加净电荷以便于纯化，以及为加入发色团的改变标为斜体。
13. 三条肽链是 T9 : Ac-R M KQ L E K K XEELLSK AQ Q LEKE A A Q L K K L V O NH2, T16：Ac-R MKQLEKK AEELLSK XQQLEKE A A Q L KKL VG- NH2, T23 ： AR M KQ LEK K AEELLSK AQ Q LEKE XA Q L K K L VG-NH2 [37] 。在所有 3 个多肽中不相同的残基标为黑体，X 表示环己基丙氨酸残基。
14. 序列基于 Acid- pLL 和 Bas pLL，它们与 Acid-pl 和 Baspl ( 见注 1 ) 相同，但核心 Asn 突变为 Leu (也见3.2.1.2 小节；第 4 条)。对 BasepLL 的两个 L—K 突变（黑体）得到 BasepK: Ac -A Q L K K K L Q A L K K K K A Q L K W K K Q A L K K K L A Q ~NH2 [38]。
15. 研究基于 GCN 4 的 N 端戴帽变体（见注 31；参考文献 [7] ) ，Asn 16 移动一个七元重复到第 9 位，产生多 肽 p-CAP: S VKELEDK NEELLSX XYHXXNEVARLKKLVG ER。与 GCN4-P1 的变化（见注 2 ) 用黑体标出。X 表示在设计计算中允许改变的位置 [39] 。
16. 研究基于设计的齐二聚盘绕螺旋 EK : A rCGALKL G A L A G A LC L G A L W LGALK- NH2。制造了 3 个盘绕螺旋突变体/其中
a. EK 中 5 个 e 位 Glu 残基（有下画线）被突变为 Gin 残基（QK 肽) ；
b. 5 个 g 位 Lys 残基（有下画线）被突变为 Gin 残基（EQ 肽）
c. 上两个变化的合并（QQ 肽）。
用双突变循环分析，计算了螺旋间离子吸引对盘绕螺旋稳定性的能量贡献 [41] 。
17. 父辈的卵黄原生成素结合蛋白 ER34 的序列： IT IR A A F L E K E N T A L R TV A E L K VGRC N I VSKYETR YG PL。有下画线的 e 和 g 残基在后来的多肽中被改变 [45 ] 。
18. 选择出的最成功的 WinZip- A 2Bl (见注 7 ) 由多肽界 L R E R V K T L R A Q N Y E L E S E V Q R L R QVAQLAS - NH2) 和 WinZip- B1 (Ac-STS VD ELQ AE VDQLQDE N Y A L K T K V A Q L R K K V E K L SE- N H 2) 组成 [8] 。
19. 研究基于设计 K - 肽 。E-肽：Ac-E L G ALE KE LG ALEKE LG ALEKE LG ALEKE LG ALEK - NH2； K- 肽：Ar-K L G ALK EK LG ALKEK L G ALK EK L G A L K E K L G A KE-NH2。16 位 和 19 位（黑体）被 变 为 Ala 以产生不同的 Leu-Ala 核心组合，2 位或 33 位（有下画线）被变为 Cys 以允许在平行或反平行态下有二硫桥 [52] 。
20. APH 的序列：MKQL LKQLK LQAIKQ LAQLQ W AQAJR K LA Q L K L A [ 55 ] 。空间匹配的核心残基 （ lie 和 Ala ) 用黑体显示；设计的 N 端谷酰胺和 C 端赖氨酸的库仑相互作用用下画线标出。且单 Arg 残基被放在 d 位（斜体），以启动二聚体生成。
21. 得到的多肽称为 Acid-al (Ac-AQ LEKE L Q AL E KE LAQLEW E N Q ALEKE LAQ - N H 2) 和 Base-al ( A c -A Q L K K K L Q AN KKK L A Q L K W K L Q A L K K K LAQ N H 2) [56]。相对于 Acid-pl 和 Base-pl ( 见注 1 ) 的改变用黑体标出。
22. 多肽 Acid-RdL ( Ac-AQ LEKE LQ ALEKE LAQREWE LQ ALE KE LAQ N H 2) 和 Base-EgL (Ac -A Q L K K K L Q A L K K E L A Q L K W K L Q A L K K K LAQ - N H 2) 是基于 Acid- a l 和 Baseal ( 见注21 )，设计的极性相互作用用黑体 [59] 。
23. 合成了 5 个带有 N 或 C 端 Cys 和核心 Ala 残基的不同的多肽。其中 3 个多肽 ( C2A 16、C33A 16和 C33A 1 9 ) 是基于七元重复 ALEG K LEALEG K LEALEG K L E A EG~NH2，并把 Cys 或者放在 2 位或者放在 33位（下画线标明），Ala 或者放在 16 位或者放在 19 位（黑体)。另外两个多肽（C33A 16 和 C33A19 ) 则基于七元重复 L A E L K G E : A c - E L A E L K G E L A E L K G E L A E L K G E LAELKG E LAEgKG ~ NH2，以 Cys 放在 33 位，而 Ala 或者放在 16 或者放在 19 为 [49] 。
24. 多肽 Acid-Kg (Ac-AQ LEKE L Q A L E K K LAQ LEW E N Q ALEKE LAQ - N H 2) 是基于 Acid -a l (见注 21) ，而多肽 BaseEg (Ac~AQLKKK LQ A N K K E L A Q L K W K L Q A L K K K LAQ - N H 2) 是基于 Base - al。变化用黑体标出。
25. 合成了具有下列序列的多肽：Ac~ (K L E A L E G ) - K - N H 2，并与羧酰胺甲基化的原肌球蛋白在 190 位的半胱氨酸（CM- 原肌球蛋白）比较。
26. 设计了一系列包含 9 个、12 个、16 个、19 个、23 个、26 个、30 个、33 个和 35 个氨基酸残基的多肤。其中 35 肽具有序列： Ac-E iealkae iealkae iealkae iealkae ieac ka- N H 2。较短的肽分别含有从 C 端算起的对应数量的氨基酸。
27. 这项研究使用肽 SucHDELERR IR ELEAR IK - N H 2 [ 64 ] 。Succ 指琥珀酰化的 N 端 。
28. 研究过的多肽是 Lac 21: Ac-M KQ LAD S LM Q LAR Q VSRLESA- N H 2，Lac 28: Ac-LM Q LAR Q MKQLADS LM Q LAR Q VSRLESA- N H 2 和 Lac 35：AcLM Q LAR Q LM Q L AR Q MKQLADS LM Q LAR Q VSRLESA- NH2 [ 65 ] 。
29. 研究系基于由具有序列 Ac- (E # §ALEK-NH2 的 E- 肽和具有序列 Ac- ( K # §ALEK-NH2 的 K-肽组成的E/K 杂二聚体。
30. 多肽序列是 Ac-g CGALQKQ VGALQIV G A L g K Q VG ALQ KQ VG AL Q K - N H 2。标了下画线的位置 1 、6 、15、2 0 和 3 4 被突变为 Gln [ 73 ]。
31. 此项研究使用重组的 GCN4-pMSE 肽 (MS VKELED K VEELLSK N Y H LE N E V A R L K K L V G E R ) 。戴帽模体用黑体标示，与 GCN4 -P 1 ( 见注 2 ) 相比较的突变用下画线标明。本研究中的其他多肽是 GCN4 -pSE，它缺少起始的甲硫氨酸和 GCN4 - p AA， 其中 GCN4-pSE 的 Ser 和 Glu 被突变为 Ala [77] 。GCN4 -pA A 的稳定性与 GCN4 - pi 可比，而 GCN4-pSE 和 GCN4-pMSE 变体比 GCN4-pAA 分别稳定了 0.5 kcal/mol 和1.2 kcal/mol。因而，末端 Met 残基的疏水贡献是 0.7 kcal/mol。
32. 为 GCN4 ( 见注 2 ) Aicd/Base 杂二聚体而设计的杂二聚盘绕螺旋 GABH 有酸性序列 A (Ac~E V K Q L E A E V E E # ESE # W H LEN E VAR LEKE NAECEA- N H 2) 和碱性序列 B (Ac~K V K Q L K A K V E E # KSK # W H L K N K V A R L K K K N AEC KAN H 2)[ 98] 。位置 d12 和 a16 ( # ) 被分别突变为 Val、lie 和 Leu，以生成多肽 All、Ail、Ali、BLl Blv。
33. 设计的序列是二聚的 R H 2 (Ac-AE IEQ LKK E §AYL IK K L K A E K L A E IK K L K Q E K A - N H 2) , H H ^ R H 3 (A c -A E # E Q # K K E IA Y L # K K # K A E IL A E #K K # K Q E IA - N H 2 ) 和四聚的 RH4 ( Ac-AE LEQ # K K E IA Y L L K K # K A E IL A EL K K # KQ E IA - N H 2)。十一元重复（a~k ) 的疏水残基（a、d 和 h ) 用黑体标明； § 标示正缬氨酸；#标示别异亮氨酸残基。
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盘绕螺旋是常见的结构，据估计在大多数基因组中占到编码残基的 3%~5% [1] 。它由 25 个 α 螺旋组成，通常以左旋这种特殊方式相互缠绕，形成一个超螺旋。一般规则的 α 螺旋形成一圈螺旋需要 3.6 个残基，而左旋盘绕螺旋则只需 3.5。这意味着每两圈螺旋含有七氨基酸的重复 [2，3] 。最常见的盘绕螺旋类型是平行（即两个螺旋并排地从 N 端盘绕到 C 端）二聚和左旋的。在这一类型中，每个螺旋的周期都是 7。在蛋白质内的任何位置都可能有 2 ( 在设计的盘绕螺旋中；参考文献 [ 4 ] )~200 个这样的重复 [ 5 ]。在这个重复中，一个螺旋的残基标记为（a - b- c - d - e - f- g ) n，另一个则标记为（a'-b'- c'- d'- e'-f '- g'）。 ( 图 3.1)。在这个模型中，a 和 b 通常是位于两个螺旋的交接处的非极性的核心残基，相反，e 和 g 是部分地溶液暴露的极性 “边缘” 残基，通过静电相互作用，它们使得两个螺旋的相互作用有特异性。最后，剩下的 3 个残基（b、c 和 f ) 是典型的亲水残基并暴露于溶液中。盘绕螺旋结构连同它的七元周期性在表观上的简单性，使它得到了大量研究。引人注目的是，两个螺旋间的相互作用仍然是高度特异性的过程。正是结构周期表面的简单性与高特异性和强亲和力相结合，使这个普遍存在的蛋白质结构类型这样地引人注目。
在天然的和设计的含 2 个 或 3 个螺旋的标准盘绕螺旋中，界面边缘的互补电荷可缓解不同螺旋间的排斥这就是以促进杂寡聚的形成。我们把这称为肽拉链（PV ) 假定 [8] 。这是在参考了 Kim 及其合作者设计的、他们称之为 “ Peptide Velcro” 的、专性杂二聚盘绕螺旋 [9] 之后提出的（Velcro 是尼龙的商品名，由两个法文单词 “ velour” —— 钩和 “crochet”——圈连成；是由钩和圈组成的带子，轻压可以将两条带子连在一起，撕拉又可以将它们分开——译者注）。除 e 和 g 位外，这两条多肽是相同的。在 e 和 g 位，一条链是 Lys，而另一条是 Glu ( 见注 2 )。像其他类似的多肽对一样，这一对多肽在试管中形成稳定的杂二聚体。最近的一项研究通过直接将理性设计和基因选择技术的结果进行比较，检验了 PV 假定 [8]。与 PV 假定相反（但与许多天然盘绕螺旋的序列性质相符），选择出的多肽对，既没有极大化相互吸引的 g/e' 电荷对，也没有消除相互排斥的 g/e' 电荷对（见 3.2.2.3)。许多因素可以影响 g/e' 带电残基的贡献。整体静电势——包括分子间的和分子内的相互作用，起主要的作用。与核心残基的相互作用，如有利的堆积或立体的冲撞，都被用来模拟 g/e' 相互作用。序列范围内的其他效应，来自于局部的螺旋柔性或来自于与 b、c 或 f 残基的相互作用，都有可能发生。对盘绕螺旋结构的检查提示，e 和 g 位在结构上有区别，这些区别可能会以不同的方式容纳不同的电荷对。
在这里，我们对每个氨基酸在维持 α 螺旋结构合促进形成符合期望的寡聚态和左旋取向的盘绕螺旋结构中所起的重要作用做一个概述。本章的目的是强调在设计或优化这类盘绕螺旋时需要考虑的重点。这一章因而应该看作是一个“指南”，为便于盘绕螺旋的设计，解释得到期望的寡聚态（见 3.2.1)、特异性（见 3.2.2) 、螺旋取向（ 见 3.2.3 ) 和稳定性（见 3.2.4 ) 所需要的最重要的操作。我们讨论在 a 和 b 疏水核心位以 及 e 和 g 静电边缘位的氨基酸残基共同的影响，以及这些残基与 b 位、c 位和 f 位残基 一起在保持 α 螺旋倾向、螺旋可溶性和二聚体整体稳定性上的作用。另外，也要讨论 N 端加帽和 C 端加帽的可能性。除非在正文中特殊地声明，我们都以二聚平行盘绕螺旋模体为参考态。我们还讨论了最近一篇述评中所述的盘绕螺旋在一般意义上的稳定性和特异性 [10] 。
对螺旋结合规律的理解使得对这些螺旋的新探索成为可能 [11] 。例如，通过将抗体 Fv 片段与螺旋融合产生被螺旋稳定的抗体；或将抗体 scFv 片段与螺旋融合以产生微小抗体（miniantibody) [13]；或作为热感应器（如连接了绿色突光蛋白的 TlpA，用突光变化作为读出信号监测 TlpA 的结构随着温度变化）。这使得由盘绕螺旋二聚体形成参与的信号传导过程的测定成为可能 [ 14 ]。
3.3 注
1. GCN4-p1 的序列：Ac-R MKQLEDK VEELLSK NYHLENE VARLKKL VGER-COOH。在 Harbmy 等的研究中 [ 16，17] 突变过的 a 和 d 残基用黑体显示。经受过许多突变研究的核心 Asn 16 标有下画线。
2. 设计的杂二聚肽拉链 [9] 为合成多肽：Acid-p1 ( At-AQLEKE LQALEKE NAQLEWE LQALEKE LAQ -NH2 ) 和 Base-p1 ( Ac-AQLKKK LQALKKK NAQLKWK LQALKKK LAQ-NH2) 。在此和随后的注中，序列中单个七元重复用空格分开。核心 Asn 残基，如已说过的经受过突变，见 3.2.1.2 (4)，标有下画线。
3. 两个半胱氨酸二硫键联结的多肽的序列 2H (Ac-KCEALEGK LEALEG KLEAAEG K LEALEGK LEALEG ~N H2 和 Ac-ELAELKG E LAELKG E AAELKG ELAELKG E LAEC KG -NH2) 和 4H （ALEG K LEALEG -N H 2 m Ac-ELAELKG E LAELKG E L AEAKG E LAELKG E L A E C K O NH 2)。为显示 2H 和 4H 中两条链间的共价连接点，半胱氨酸用黑体示出，而规定寡聚态的 Ala 用下画线示出。
4. 鼠 COMP 蛋白的盘绕螺旋结构域（氨基酸 27~72) 序列（21 )：RE L Q E T N A A LQ D VR EL LRQQ VKE IT F L K N T VMECDACG。在鼠 COMP 的表达片段中，Gly 27 被 Met 所取代。
5. 研究基于多肽 A1 ( M R G SH H H H H H G SM A SGDLENE YAQLERE VRSLEDE AA ELE Q K VSRLKNE IE D L A E I GDLNNTSGIRRPAA K L N ) 。三氟亮氨酸和六氟亮氨酸的掺入以取代亮氨酸（黑体），通过在没有亮氨酸的培养液中加入三氟亮氨酸或六氟亮氨酸，用基因表达 [ 22，23] 。
6. 如注 2 所说明的，Kretsinger 等的研究系基于 GCN4-p1 多肽。他们将 C 端酰胺化，并报道了在第一个七元重复的 Asp 和 Lys 间插入 Set 的序列 [ 24 ] 。因为这一插入会移动七元重复，我们可以假定这是图中的一个错误。有下画线的 Asn ( 见注 2 ) 被变为 Asp 二氨基庚二酸（diaminopropionic acid) 及其一、二和三甲基化类似物。
7. 本节中，杂二聚体系从两个设计的盘绕螺旋库中选出：LibA : V A Q L # E #V K T L # A # § Y E L # S # V Q R L # E # V A Q L fq L ib B ： V D E L # A # V D Q L # D # Y A L # T # V A Q L # K # V E K L，其中，# 表示 E 、Q 、K 和 R 的等摩尔混合， § 表示 V 和 N 的等摩尔混合[ 31] 。核心 a 位和 d 位的序列来自于GCN4 (见注 2 )，而 b 位、c 位和 f 位的序列（有下画线）来自 c-Jun ( R LEEK VILKQ NLA T AN M LR EQ VA Q L ) 和 c-Fos ( TTLQ E TLE Q E K Y A L Q T E IA N L L K E KSL) 的盘绕螺旋结构域。
8. GCN4-pVL 变体的序列是 ArR MKQ LED K VEELSK YH LEN E V A R L K K L V G E R ，其中 a 位和 d 位用黑体显示。用 # 表示的 12 位（ d ) 或者是 Leu，或者是一个极性残基（N 、Q 、S 或 T )，用 § 表示的 16 位 （ a ) 或者是 Val，或者是一个极性残基 [ 25 ] 。
9. 两项研究都使用二硫键桥接的盘绕螺旋。此螺旋基于序列 VG ALKKE，做了一些修正以避免链内和链间与替换位点（X )的电荷-电荷相互作用，并调节整体电荷。其序列分别是 Ac-CGGE VG ALKAQ VGALQAQ XGALQKE VGALKKE VGALKK- NH2 [ 33] 和 ACGGE VGALKAE VG ALKAQ IG AX-Q KQ IG ALQ KE VGALKK- NH2 [32]。
10. Ji 等使用了记为 N36 ( L 6 ) C 34 的猿猴免疫缺陷病毒 gp41 核心的重组模型， 其中的氨基端螺旋（N36 ) 构成中心的三聚盘绕螺旋，而羧基端螺旋（C34 ) 以反平行 的取向堆积到此盘绕螺旋三聚体的疏水凹槽中。N36 和 C34 被一短联结子分开（L6；参考文献 [ 34 ] ) 。在 N36 结构域中，极性核心残基（黑体 ）突变为 lie : AG IVQ Q QQQ LLD V VKR Q Q EL LR LTVW G T K N L Q T R V T 。产生不溶聚集的 Q→I 突变用下画线标出。
11. 父辈多肽 Lac21 的序列是 Ac- ML A D S LM Q LAR Q VLESA- NH2 (见注 28)。有下画线的残基被突变为 E 或 K，以分别产生形成杂四聚的多肽 Lac21E 和 Lac21K [ 35 ] 。
12. APC-55 的序列：AAAS Y D Q L L K Q V E A L K M E N S N L R Q E L E D N S N H LTK L ET E ASN M KEV LKQLQGSI 和 anti-APC p1 的序列：MAA GDQLK V EA L YE NSNLRKL EDHL TKLTE IS N A K K M LKQ LYASI [36]。antiAPCp1 与 APC-55 相比较的核心变化用黑体标出；e 位 和 g 位的改变用下画线标示；为 增加稳定性、增加净电荷以便于纯化，以及为加入发色团的改变标为斜体。
13. 三条肽链是 T9 : Ac-R M KQ L E K K XEELLSK AQ Q LEKE A A Q L K K L V O NH2, T16：Ac-R MKQLEKK AEELLSK XQQLEKE A A Q L KKL VG- NH2, T23 ： AR M KQ LEK K AEELLSK AQ Q LEKE XA Q L K K L VG-NH2 [37] 。在所有 3 个多肽中不相同的残基标为黑体，X 表示环己基丙氨酸残基。
14. 序列基于 Acid- pLL 和 Bas pLL，它们与 Acid-pl 和 Baspl ( 见注 1 ) 相同，但核心 Asn 突变为 Leu (也见3.2.1.2 小节；第 4 条)。对 BasepLL 的两个 L—K 突变（黑体）得到 BasepK: Ac -A Q L K K K L Q A L K K K K A Q L K W K K Q A L K K K L A Q ~NH2 [38]。
15. 研究基于 GCN 4 的 N 端戴帽变体（见注 31；参考文献 [7] ) ，Asn 16 移动一个七元重复到第 9 位，产生多 肽 p-CAP: S VKELEDK NEELLSX XYHXXNEVARLKKLVG ER。与 GCN4-P1 的变化（见注 2 ) 用黑体标出。X 表示在设计计算中允许改变的位置 [39] 。
16. 研究基于设计的齐二聚盘绕螺旋 EK : A rCGALKL G A L A G A LC L G A L W LGALK- NH2。制造了 3 个盘绕螺旋突变体/其中
a. EK 中 5 个 e 位 Glu 残基（有下画线）被突变为 Gin 残基（QK 肽) ；
b. 5 个 g 位 Lys 残基（有下画线）被突变为 Gin 残基（EQ 肽）
c. 上两个变化的合并（QQ 肽）。
用双突变循环分析，计算了螺旋间离子吸引对盘绕螺旋稳定性的能量贡献 [41] 。
17. 父辈的卵黄原生成素结合蛋白 ER34 的序列： IT IR A A F L E K E N T A L R TV A E L K VGRC N I VSKYETR YG PL。有下画线的 e 和 g 残基在后来的多肽中被改变 [45 ] 。
18. 选择出的最成功的 WinZip- A 2Bl (见注 7 ) 由多肽界 L R E R V K T L R A Q N Y E L E S E V Q R L R QVAQLAS - NH2) 和 WinZip- B1 (Ac-STS VD ELQ AE VDQLQDE N Y A L K T K V A Q L R K K V E K L SE- N H 2) 组成 [8] 。
19. 研究基于设计 K - 肽 。E-肽：Ac-E L G ALE KE LG ALEKE LG ALEKE LG ALEKE LG ALEK - NH2； K- 肽：Ar-K L G ALK EK LG ALKEK L G ALK EK L G A L K E K L G A KE-NH2。16 位 和 19 位（黑体）被 变 为 Ala 以产生不同的 Leu-Ala 核心组合，2 位或 33 位（有下画线）被变为 Cys 以允许在平行或反平行态下有二硫桥 [52] 。
20. APH 的序列：MKQL LKQLK LQAIKQ LAQLQ W AQAJR K LA Q L K L A [ 55 ] 。空间匹配的核心残基 （ lie 和 Ala ) 用黑体显示；设计的 N 端谷酰胺和 C 端赖氨酸的库仑相互作用用下画线标出。且单 Arg 残基被放在 d 位（斜体），以启动二聚体生成。
21. 得到的多肽称为 Acid-al (Ac-AQ LEKE L Q AL E KE LAQLEW E N Q ALEKE LAQ - N H 2) 和 Base-al ( A c -A Q L K K K L Q AN KKK L A Q L K W K L Q A L K K K LAQ N H 2) [56]。相对于 Acid-pl 和 Base-pl ( 见注 1 ) 的改变用黑体标出。
22. 多肽 Acid-RdL ( Ac-AQ LEKE LQ ALEKE LAQREWE LQ ALE KE LAQ N H 2) 和 Base-EgL (Ac -A Q L K K K L Q A L K K E L A Q L K W K L Q A L K K K LAQ - N H 2) 是基于 Acid- a l 和 Baseal ( 见注21 )，设计的极性相互作用用黑体 [59] 。
23. 合成了 5 个带有 N 或 C 端 Cys 和核心 Ala 残基的不同的多肽。其中 3 个多肽 ( C2A 16、C33A 16和 C33A 1 9 ) 是基于七元重复 ALEG K LEALEG K LEALEG K L E A EG~NH2，并把 Cys 或者放在 2 位或者放在 33位（下画线标明），Ala 或者放在 16 位或者放在 19 位（黑体)。另外两个多肽（C33A 16 和 C33A19 ) 则基于七元重复 L A E L K G E : A c - E L A E L K G E L A E L K G E L A E L K G E LAELKG E LAEgKG ~ NH2，以 Cys 放在 33 位，而 Ala 或者放在 16 或者放在 19 为 [49] 。
24. 多肽 Acid-Kg (Ac-AQ LEKE L Q A L E K K LAQ LEW E N Q ALEKE LAQ - N H 2) 是基于 Acid -a l (见注 21) ，而多肽 BaseEg (Ac~AQLKKK LQ A N K K E L A Q L K W K L Q A L K K K LAQ - N H 2) 是基于 Base - al。变化用黑体标出。
25. 合成了具有下列序列的多肽：Ac~ (K L E A L E G ) - K - N H 2，并与羧酰胺甲基化的原肌球蛋白在 190 位的半胱氨酸（CM- 原肌球蛋白）比较。
26. 设计了一系列包含 9 个、12 个、16 个、19 个、23 个、26 个、30 个、33 个和 35 个氨基酸残基的多肤。其中 35 肽具有序列： Ac-E iealkae iealkae iealkae iealkae ieac ka- N H 2。较短的肽分别含有从 C 端算起的对应数量的氨基酸。
27. 这项研究使用肽 SucHDELERR IR ELEAR IK - N H 2 [ 64 ] 。Succ 指琥珀酰化的 N 端 。
28. 研究过的多肽是 Lac 21: Ac-M KQ LAD S LM Q LAR Q VSRLESA- N H 2，Lac 28: Ac-LM Q LAR Q MKQLADS LM Q LAR Q VSRLESA- N H 2 和 Lac 35：AcLM Q LAR Q LM Q L AR Q MKQLADS LM Q LAR Q VSRLESA- NH2 [ 65 ] 。
29. 研究系基于由具有序列 Ac- (E # §ALEK-NH2 的 E- 肽和具有序列 Ac- ( K # §ALEK-NH2 的 K-肽组成的E/K 杂二聚体。
30. 多肽序列是 Ac-g CGALQKQ VGALQIV G A L g K Q VG ALQ KQ VG AL Q K - N H 2。标了下画线的位置 1 、6 、15、2 0 和 3 4 被突变为 Gln [ 73 ]。
31. 此项研究使用重组的 GCN4-pMSE 肽 (MS VKELED K VEELLSK N Y H LE N E V A R L K K L V G E R ) 。戴帽模体用黑体标示，与 GCN4 -P 1 ( 见注 2 ) 相比较的突变用下画线标明。本研究中的其他多肽是 GCN4 -pSE，它缺少起始的甲硫氨酸和 GCN4 - p AA， 其中 GCN4-pSE 的 Ser 和 Glu 被突变为 Ala [77] 。GCN4 -pA A 的稳定性与 GCN4 - pi 可比，而 GCN4-pSE 和 GCN4-pMSE 变体比 GCN4-pAA 分别稳定了 0.5 kcal/mol 和1.2 kcal/mol。因而，末端 Met 残基的疏水贡献是 0.7 kcal/mol。
32. 为 GCN4 ( 见注 2 ) Aicd/Base 杂二聚体而设计的杂二聚盘绕螺旋 GABH 有酸性序列 A (Ac~E V K Q L E A E V E E # ESE # W H LEN E VAR LEKE NAECEA- N H 2) 和碱性序列 B (Ac~K V K Q L K A K V E E # KSK # W H L K N K V A R L K K K N AEC KAN H 2)[ 98] 。位置 d12 和 a16 ( # ) 被分别突变为 Val、lie 和 Leu，以生成多肽 All、Ail、Ali、BLl Blv。
33. 设计的序列是二聚的 R H 2 (Ac-AE IEQ LKK E §AYL IK K L K A E K L A E IK K L K Q E K A - N H 2) , H H ^ R H 3 (A c -A E # E Q # K K E IA Y L # K K # K A E IL A E #K K # K Q E IA - N H 2 ) 和四聚的 RH4 ( Ac-AE LEQ # K K E IA Y L L K K # K A E IL A EL K K # KQ E IA - N H 2)。十一元重复（a~k ) 的疏水残基（a、d 和 h ) 用黑体标明； § 标示正缬氨酸；#标示别异亮氨酸残基。
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