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人造锌指蛋白的设计和合成

丁香园

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1. 介绍

人造锌指蛋白在生物医学研究和基因疗法中有重要应用,而且是生物化学和分子生物学研究的新工具 [ 1~3 ] 。特 别是(Cys)2 (His)2 型锌指模体(真核细胞中最常见的 DNA 结合模体)为新的 DNA 结合蛋白设计提供通用的、引人瞩目的框架。对某些 (Cys)2(His)2 型锌指蛋白-DNA 复合物揭示出这一模体与 DNA 结合的下列特征:

(1 ) 锌指结构用一特异的连接子反复连接;

( 2 ) 每一个锌指结构结合到 DNA 的一个三碱基对位置上,以其螺旋对着主沟槽;

( 3 ) α 螺旋的每一锌指单元的 4 个关键位置上的氨基酸残基与 DNA 碱基在特定位置上 1 : 1 的接触;

( 4 ) ( 锌指)多肽的整体排列是与 DNA 主要相互作用股反向平行的 [4~7] 。

基于这些特征,科学家们成功地制造了某些锌指蛋白,如长序列或 AT 序列结合锌指。这样设计的 DNA 结合蛋白,可以期待拥有具髙亲和力和特异性的唯一结合序列。还设计了新的锌指蛋白,如 DNA 弯折锌指和(His)4 型锌指。这些人工的锌指蛋白,在不久的将来,为基因工程和基因组特异的转录开关提供了巨大的希望和有用的工具。



2. 材料

( 1 ) pET3b 表达系统(Novagen)。

( 2 ) 互补 DNA 编码 Sp1 锌指。

( 3 ) 大肠杆菌菌株 DH5α 和 BL21 ( DE3 )  pLysS。

( 4 ) 正文中描述的寡核苷酸引物。

( 5 ) 限制酶,T7DNA 聚合酶和 T4DNA 连接酶。

( 6 ) DNA 测序仪(Amersham  Biosciences)。

( 7 ) Luria- Bertam 培养基:10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母抽提物和 10 g 氯化钠,加水至终体积 1 L。

( 8 ) 氨苄青霉素。

( 9 ) 异丙基-β-D-硫代-吡喃半乳糖苷(IPTG )。

( 10 ) 超声裂解设备。

( 11 ) 磷酸缓冲生理盐水(PBS): 10 mmol/L 磷酸缓冲液,pH 7.6,130 mmol/L 氯化钠和 2.7 mmol/L 氯化钾。

( 12 ) 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 设备。

( 13 ) 色谱设备。

( 14 ) 高 S 色谱柱(Bio- Rad)。

( 15 ) UNO-S1 色谱柱(Bio- Rad)。

( 16 ) Superdex 75  (Amershan  Biosciences)。

( 17 ) 50 mmol/L Tris-氯化氢,pH 8.0,50 mmol/L 氯化钠和 1 mmol/L 二硫苏糖醇。

( 18 ) PAGE 设备。

( 19 ) DNA 测序设备。

( 20 ) 9-芴甲氧羰基固相合成设备。

( 21 ) 三氟乙酸:乙醇(95 : 5 ) 溶液。

( 22 ) 高效液相色谱设备。

( 23 ) μBonedespliere5C4-300 (19 mm X 150 mm) 柱 。

( 24 ) 飞行时间质谱设备。

( 25 ) 圆二色(CD) 谱设备。

( 26 ) 紫外-可见(UV-VIS ) 光谱仪。

( 27 ) 核磁共振(NMR) 设备。

4. 注

1. Kriippel 型连接子(Thr-Gly-Glu-Lys-Pro,TGEKP) 在许多锌指蛋白中是保守的,因而被选来连接 Sp1 的锌指结构域。这些人工多锌指蛋白显示出扩展了的序列特异性,并且它们对序列的偏好取决于模体数量和 Sp1 3 锌指 DNA 结合结构域的特征。

2. 显然,足迹分析证明,现有的人工锌指蛋白中 Sp1ZF6 和 Sp1ZF9,使用它们所有的锌指结构域分别与 DNA 序列中的最少 18 和 27 个连续的 GC 富集碱基对结合。

3. 新设计的 6 锌指蛋白 Sp1ZF6 ( Gly )7Sp1ZF6 ( Gly )10  能够在两个末端的结合部位交界处引起 DNA 弯折,并且,两个 3 锌指模体间连接子的长度对整个 DNA 弯折的方向起关键作用。相检测强烈地支持所引起的 DNA 弯折朝向 DNA 的主沟槽,并且,Sp1ZF6 ( Gly )7  引起 DNA 弯折最强烈的方向改变。

4. 通过用不同的带电连接子连接 Sp1 的两个 DNA 结合结构域,我们也制造了 6 锌指蛋白 Sp1ZF6 (Gly·Arg )4 和  Sp1ZF6 (Gly·Glu)4 ( 见参考文献[14])。

5. 新的(His)4 型锌指蛋白在自然界中从未观察到。特别有趣的是,人工(His)4 型 Sp1 的锌指结构域折叠和结合于 DNA 都类似于野生(Cys)2 (His)2 型 Sp1。

6. 在大多数天然蛋白中,含(Cys)2 (His)2 型锌指结构域的,都结合到 GC 富集序列,AT 识别的锌指蛋白非常稀少。用 α 螺旋替换,制造识别 AT 富集序列的锌指蛋白,是方便的和有用的。

7. 我们的 α 螺旋替换策略,在制造与 AT 富集和 GC 富集交替序列结合的锌指蛋白也是有效的。

参考文献

1.  Nagaoka,  M. and Sugiura,  Y.  (2000)  Artificial zinc finger peptides:  creation,  DNA recognition,  and gene regulation.  J .  Inorg. Biochem.82,  57-63.

2.  Imanishi, M ., Hori, Y _ , Nagaoka, M ., and  Sugiura, Y.  (2001 )  Design  of  novel  zinc finger  proteins:  towardsartificial  control of  specific gene  expression.  Eur.J .  Pharm. Sci.  13 ,  91-97.

3.  Pabo,  C. O.  ,  Peisach,  E.  ,  and  Grant,  R. A.  ( 2 0 0 1 )  Design  and  selection  of  novel  Cys2 His2  zinc  fingerproteins. Annu, Rev, Biochem,70,  313-340.

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14.  Imanishi,  M. and Sugiura,  Y.  (2002)  Artificial DNA-bending six-zinc finger peptides with different charged linkers:  Distinct  kinetic properties of DNA binding.  Biochemistry  4 1 ,  13 28-1334.
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