材料与仪器
寡核苷酸引物
氨苄青霉素 磷酸缓冲生理盐水 Tris-氯化氢 SDS-PAGE
DNA 测序仪 色谱设备
氨苄青霉素 磷酸缓冲生理盐水 Tris-氯化氢 SDS-PAGE
DNA 测序仪 色谱设备
步骤
本节描述的方法大概包括：
( 1 ) 设计的锌指蛋白的表达和纯化。
( 2 ) 人工锌指设计技巧。
( 3 ) 人工锌指构建步骤。
( 4 ) 锌指结构和金属配位的确认。
3.1 人工锌指蛋白的表达和纯化
设计的人工锌指蛋白的表达和纯化方法在 3.1.1 和 3.1.6 节描述，包括：
( 1 ) 表达载体 pEV-3b 的构建；
( 2 ) 蛋白质以可溶和不可溶形式表达；
( 3 ) 用阳离子交换和凝胶过滤色谱纯化蛋白；
( 4 ) 失活结构的再折叠；
( 5 ) 锌指结构和金属配位的确认。
3.1.1 pEV-3b 表达载体
pEV-3b 表达载体是基于 pET3b 表达载体（Novagen；图 5.1 )。这个载体被改造过，以生成有用的多克隆位点，用于研究锌指基因。
( 1 ) 从 pET3b 中切除 EcoRI/Hind lll 降解片段。
( 2 ) 为了切除 EcoRI 和位点，将退火的寡核苷酸 5'-AATTGTCATGTTTGAC-3，和 5，- AGCTGTCAAACATGAC-3，插入 EcoRI/Hind lll 降解的 pET3b。产生的质粒记为 pET3b'。
( 3 ) 制备包括限制性酶 AflII 、Bam HI、EcoRI、Hind lll 和 S mal 酶切位点的双链寡核苷酸。这两条链的序列为 5'-TATGGATCCCGGGAATTCAAGCTTAAGC-3' 和 5'-TCAGCTTAAGCTTGAATTCCCGGGATCCA-3'。
( 4 ) 用 Nde l 和降解，并将这一片段插入 pET3b'，得到质粒 pEV-3b。
得到的质粒 pEV-3b 用来表达设计的锌指蛋白。把锌指基因作为 Bam HI/EcoRI 片段插入类似地降解的 pEV-3b，只用一步就构建了人工锌指的表达载体。
3.1.2 设计的人工锌指蛋白的表达
( 1 ) 把带有设计的锌指蛋白基因的 pEV-3b 质粒转化到大肠杆菌菌株 BL21 ( DE3 ) pLysS 中。
( 2 ) 在 37°C 于 Luria- Bertani 培养基中培养细胞。
( 3 ) 当在 600 nm 的光密度为 0.6 时加入 1 mmol/L IPTG。
( 4 ) 培养液在 20°C 保育 8~12 h。为了表达溶解状态的蛋白质，这个温度很重要。
3.1.3 设计的人工锌指蛋白的纯化
纯化步骤在 4°C 下完成。
( 1 ) 收获大肠杆菌细胞，重悬，并在 PBS 中裂解。
( 2 ) 离心后，用阳离子交换色谱（高 S 和 UNO S-1；Bio- Rad) 和用 Tris-氯化氢缓冲液凝胶过滤（Superdex 75；Amersham Biosciences)，纯化溶有锌指蛋白的上清液。
( 3 ) 用 SDS-PAGE 确认蛋白纯度。
为进行金属取代实验，不溶形式的锌指蛋白也在离心后从大肠杆菌细胞小团中纯化出来：
( 1 ) 在含 8 mmol/L 尿素和 10 mmol/L 螯合剂（EDTA 或 1，10-邻二氮杂菲）的 PBS 中裂解细胞小团。
( 2 ) 根据 3.1.3 小节 第（2 ) 步的描述，以同样步骤纯化。
( 3 ) 在 65°C 加热纯化蛋白 30 min，并在含 125 μmol/L 氯化锌、硝酸镍、氯化镉、 硝酸钴或硫酸铜的 10 mmol/L Tris 缓冲液中逐步降温，使之重新折叠。
3.1.4 CD 测量
锌指蛋白的 CD 谱用 Jasco J-720 分光偏振计记录。20°C，使用 pH 8.0 的含有 50 mmol/L 氯化钠的 Tris-氯化氢缓冲液。容器须有盖，1 mm 光程，氮气环境。所有的谱平均扫描 8~16 次。使用 Jasco 软件校准谱的基线并降低噪声。
3.1.5 UV-VIS 吸收谱
UV-VIS 吸收谱用 Beckman Coulter DU7400 二极管阵列光谱仪，20°C，使用 pH 7.5 的含 50 mmol/L 氯化钠的 10 mmol/L Tris-氯化氢缓冲液。容器须有盖，1 cm 光程。Co (II) - 取代的锌指复合物用氯化钴滴定得到。多肽在任意条件下用 Co (I I ) 饱和。所有的谱都用 e = A / ( l/c) ，式中 e 是消光系数 {/ [ (mol/L ) /cm]} ， l 是容器的光程 (cm)，c 是肽浓度（mol/L )。
3.1.6 NMR 实验
在 1.5 mol Zn ( II ) 离子存在的条件下，单指结构域和 Zn (II) 的复合物在 90% H2O/10% D2O 和 D2O ( 25 mmol/L Tris-d11，pH 5.7 ) 中，以 5 mmol/L 浓度制备。所有的 NMR 谱都在 JOEL Lambda-600 谱仪上记录。
( 1 ) 核 Overhauser 增强谱（NOESY) 数据采集，先用选择性水预饱和（交替的延迟与进动以裁剪激发脉冲；一种水峰信号抑制技术，缩写为 DANTE；原文 mutation 当为 nutation 之误---- 译者注），随后温度定在 303 K , 各使用混合时间分别为 100ms、200ms 和 300ms 的标准 NOESY 脉冲序列。
( 2 ) 采集总相关谱，用 80 ms MLEV-17 自旋锁闭时长，在 303 K 用梯度修整脉冲以压制水信号。
谱的典型采集条件是每个 t1 值（原文 valve 当为 value 之误——译者注）扫描 24 次，共 1024 个 t1 值，并且在直接维度收集 2048 个复数点。在两个维度的自由感应衰减被乘以相移正弦钟形限形函数、零填充，并经傅里叶变换为 2048X2048 矩阵。序列共振指认用标准的总相关谱和 NOESY 过程确定 [8] 。
3.2 6 和 9 锌指蛋白
本节描述为识别长 DNA 序列所需的多锌指蛋白的设计策略和构建。
3.2.1 蛋白质设计策略
全新的 6 和 9 锌指蛋白（SplZF6 和 SplZF9 ) 是从转录因子 Sp1 的 3 锌指模体创造出来的（图 5.2 )。通过用 Kriippel 型连接子连接 2 或 3 个 Spl 锌指结构域，构建出了这些蛋白质（见注 1 和注 2)。
3.2.2 Sp1ZF6 和 Sp1ZF9 基因的构建
编码 Sp1 的 3 锌指区域的基因 [pUC-Spl ( 530~623) ] 按如先前描述过的步骤构建 [9] 。
( 1 ) 合成编码 Kriippel 型连接子（TGEKP ) 的一段寡核苷酸（84 bp) 为 BamHI/Sty I 片段，并将其插入 pUC-Spl (530~623) 。
( 2 ) 切出 Eco47 III 片段（264 bp) ，并将其插入简单降解过的 pUC-Sp1 (530~623) 中。改变后的质粒重新命名为 pUC-Sp1ZF6。
( 3 ) 用 Agel 位引物对，即用 5'-ACCGGTGAAAAACCGCATATTTGCCACATAC-3' 为编码链，并用 5'-CGGTTTTTCACCGGTGTGGGTCTTGATATG-3' 为非编码链，将两个 AgeI 位分别连接到编码 SplZF9 的中间基因的 5' 端和 3' 端。
( 4 ) 把得到的用 Agel 修饰过的片段连接到 pUC-SplZF6 的 AgeI 位置。连接 2 或 3 个 Spl 片段间的 AgeI 酶切位点编码氨基酸 TG，它是连接肽 TGEKP 的一部分。
( 5 ) 用 DNA 测序确认所有序列。
( 6 ) 作为 BamHI/Styl 片段切出 SplZF6 和 SplZF9 的 DNA 片段，并将其插入简单降解过的质粒 pEV-3b 中（见 3.1 .1；参考文献 [10] ) 。
3.3 DNA 弯折锌指蛋白
3.3.1 和 5.3.3. 2 节描述 DNA 弯折锌指的设计和构建。
3.3.1 蛋白设计步骤
通过连接 SP1 的 2 个 3 锌指，构建出了新的 6 锌指蛋白，包括多聚甘氨酸连接子、 SplZF6 (Gly)4、SplZF6 (Gly)7 (图 5.3 ) 和 SplZF6 (Gly)1。交换 SplZF6 的 TGEKP 和 (Gly)n（n =4、7 或 10 ) 连接子，可以构建 SplZF6 (Gly)n ( 见注 3 和注 4)。
3.2 SplZF6 (Gly)n 的构建
包含有连接序列的合成寡聚核苷酸 A flll/Mfel 是从 Amer sham Biosciences 购置的。经过退火，这些寡聚核苷酸片段被插入到 pUC-Sp1ZF6 载体中。这样得到的质粒被重新命名为 Sp1ZF6 (Gly)n ( n = 4 , 7 或 10)。这些编码蛋白质的 DNA 片段在 Bam HI 和 Eco RI 位点被剪切下来，然后插入一个被同样酶切的质粒，pEV-3b (见 5. 3.1 .1；参考文献 [ 11 ])。
3.4 (His)4 型锌指蛋白
3.4.1 和 3.4.2 节描述 (His)4 型锌指蛋白的设计技巧、多肽合成和基因构建。
3.4.1 蛋白质设计策略通过对 3 (Cys)2 (His)2 型锌指蛋白 Sp1 做突变 CysHis，创造出了一个新的 (His)4 型锌指蛋白（图 5.4)。实质上，存在（Cys)2 (His)2 — 、（Cys)3 (His) — 、 (Cys)4—和（Cys)6 —锌指蛋白（见注 5)。
3.4.2 (His)4 型锌指结构域的多肽合成
合成 3 锌指 Sp1 之中指的（His)4 突变多肽（H4Sp1f2 )，在 Rink 氨基树脂上用 9-芴甲氧羰基固相合成。肽链在 Shimadzu PSSM-8 合成仪上采用苯并三唑-1- 基氧 3 四氢吡咯磷、六氟合磷酸、（PyBOP) -1- 羟基苯并三氮唑 、（HOBO - N-甲基吗磷啉、 (NMM ) 耦合系统标准工艺合成。被保护起来的 H4Sp1f2 肽树脂，用三氟乙酸和乙醇 ( 95 : 5 ) 在室温下处理 2 h，接着用高效液相色谱在 μBondesphere4C4-300 (19 X 50 mm) 柱上纯化。产物的可靠性用飞行时间质谱（Kratos Kompact MALDI4 ) 验证。
3.4.3 H4Sp1 的构建
(His)4 突变体 H4Sp1 通过将 Sp1 的 3 锌指结构域的 6 个半胱氨酸突变为组氨酸构建。 编码（His)4 的 DNA 片段，从 pUC-Sp1 (530-623) 用基于点突变的聚合酶链反应（PCR ) 得到，并且用 GeneRapidDNA (Amersham Biosciences ) 测序仪验证。扩增的片段用 BamHI 和 Eco RI 切割后，插入简单降解过的 pEY-3b 中（见 3.1.1; 参考文献 [12])。
3.5 AT 识别锌指蛋白
识别 AT 的锌指的设计和构建分别在 3.5.1 和 3.5.2 节中描述。
3.5.1 蛋白质设计策略
(Cys)2 (His)2 型锌指蛋白 Sp1 中的 3 锌指结合于富含 GC 的序列，而 6 (Cys)2(His)2 型锌指蛋白 CF2- II 中的 3 锌指（4~6 指）结合于富含 AT 的序列。新的与 AT 富集序列结合的锌指蛋白，用交换这两个类型的锌指蛋白的螺旋来合成（图 5.5)。
3.5.2 Sp1HM 的构建
制备编码 CF2- II 的 α 螺旋的寡核苷酸。基于 PCR 的点突变，用 pUC-Sp1 ( 530~623 ) 作为模板来逆行。PCR 扩增的突变片段用 Bam HI 和 Eco RI 降解后，插入简单地降解过的 pEV-3b 质粒中（见 3.1.1；参考文献 [13])。
( 1 ) 设计的锌指蛋白的表达和纯化。
( 2 ) 人工锌指设计技巧。
( 3 ) 人工锌指构建步骤。
( 4 ) 锌指结构和金属配位的确认。
3.1 人工锌指蛋白的表达和纯化
设计的人工锌指蛋白的表达和纯化方法在 3.1.1 和 3.1.6 节描述，包括：
( 1 ) 表达载体 pEV-3b 的构建；
( 2 ) 蛋白质以可溶和不可溶形式表达；
( 3 ) 用阳离子交换和凝胶过滤色谱纯化蛋白；
( 4 ) 失活结构的再折叠；
( 5 ) 锌指结构和金属配位的确认。
3.1.1 pEV-3b 表达载体
pEV-3b 表达载体是基于 pET3b 表达载体（Novagen；图 5.1 )。这个载体被改造过，以生成有用的多克隆位点，用于研究锌指基因。
( 1 ) 从 pET3b 中切除 EcoRI/Hind lll 降解片段。
( 2 ) 为了切除 EcoRI 和位点，将退火的寡核苷酸 5'-AATTGTCATGTTTGAC-3，和 5，- AGCTGTCAAACATGAC-3，插入 EcoRI/Hind lll 降解的 pET3b。产生的质粒记为 pET3b'。
( 3 ) 制备包括限制性酶 AflII 、Bam HI、EcoRI、Hind lll 和 S mal 酶切位点的双链寡核苷酸。这两条链的序列为 5'-TATGGATCCCGGGAATTCAAGCTTAAGC-3' 和 5'-TCAGCTTAAGCTTGAATTCCCGGGATCCA-3'。
( 4 ) 用 Nde l 和降解，并将这一片段插入 pET3b'，得到质粒 pEV-3b。
得到的质粒 pEV-3b 用来表达设计的锌指蛋白。把锌指基因作为 Bam HI/EcoRI 片段插入类似地降解的 pEV-3b，只用一步就构建了人工锌指的表达载体。
3.1.2 设计的人工锌指蛋白的表达
( 1 ) 把带有设计的锌指蛋白基因的 pEV-3b 质粒转化到大肠杆菌菌株 BL21 ( DE3 ) pLysS 中。
( 2 ) 在 37°C 于 Luria- Bertani 培养基中培养细胞。
( 3 ) 当在 600 nm 的光密度为 0.6 时加入 1 mmol/L IPTG。
( 4 ) 培养液在 20°C 保育 8~12 h。为了表达溶解状态的蛋白质，这个温度很重要。
3.1.3 设计的人工锌指蛋白的纯化
纯化步骤在 4°C 下完成。
( 1 ) 收获大肠杆菌细胞，重悬，并在 PBS 中裂解。
( 2 ) 离心后，用阳离子交换色谱（高 S 和 UNO S-1；Bio- Rad) 和用 Tris-氯化氢缓冲液凝胶过滤（Superdex 75；Amersham Biosciences)，纯化溶有锌指蛋白的上清液。
( 3 ) 用 SDS-PAGE 确认蛋白纯度。
为进行金属取代实验，不溶形式的锌指蛋白也在离心后从大肠杆菌细胞小团中纯化出来：
( 1 ) 在含 8 mmol/L 尿素和 10 mmol/L 螯合剂（EDTA 或 1，10-邻二氮杂菲）的 PBS 中裂解细胞小团。
( 2 ) 根据 3.1.3 小节 第（2 ) 步的描述，以同样步骤纯化。
( 3 ) 在 65°C 加热纯化蛋白 30 min，并在含 125 μmol/L 氯化锌、硝酸镍、氯化镉、 硝酸钴或硫酸铜的 10 mmol/L Tris 缓冲液中逐步降温，使之重新折叠。
3.1.4 CD 测量
锌指蛋白的 CD 谱用 Jasco J-720 分光偏振计记录。20°C，使用 pH 8.0 的含有 50 mmol/L 氯化钠的 Tris-氯化氢缓冲液。容器须有盖，1 mm 光程，氮气环境。所有的谱平均扫描 8~16 次。使用 Jasco 软件校准谱的基线并降低噪声。
3.1.5 UV-VIS 吸收谱
UV-VIS 吸收谱用 Beckman Coulter DU7400 二极管阵列光谱仪，20°C，使用 pH 7.5 的含 50 mmol/L 氯化钠的 10 mmol/L Tris-氯化氢缓冲液。容器须有盖，1 cm 光程。Co (II) - 取代的锌指复合物用氯化钴滴定得到。多肽在任意条件下用 Co (I I ) 饱和。所有的谱都用 e = A / ( l/c) ，式中 e 是消光系数 {/ [ (mol/L ) /cm]} ， l 是容器的光程 (cm)，c 是肽浓度（mol/L )。
3.1.6 NMR 实验
在 1.5 mol Zn ( II ) 离子存在的条件下，单指结构域和 Zn (II) 的复合物在 90% H2O/10% D2O 和 D2O ( 25 mmol/L Tris-d11，pH 5.7 ) 中，以 5 mmol/L 浓度制备。所有的 NMR 谱都在 JOEL Lambda-600 谱仪上记录。
( 1 ) 核 Overhauser 增强谱（NOESY) 数据采集，先用选择性水预饱和（交替的延迟与进动以裁剪激发脉冲；一种水峰信号抑制技术，缩写为 DANTE；原文 mutation 当为 nutation 之误---- 译者注），随后温度定在 303 K , 各使用混合时间分别为 100ms、200ms 和 300ms 的标准 NOESY 脉冲序列。
( 2 ) 采集总相关谱，用 80 ms MLEV-17 自旋锁闭时长，在 303 K 用梯度修整脉冲以压制水信号。
谱的典型采集条件是每个 t1 值（原文 valve 当为 value 之误——译者注）扫描 24 次，共 1024 个 t1 值，并且在直接维度收集 2048 个复数点。在两个维度的自由感应衰减被乘以相移正弦钟形限形函数、零填充，并经傅里叶变换为 2048X2048 矩阵。序列共振指认用标准的总相关谱和 NOESY 过程确定 [8] 。
3.2 6 和 9 锌指蛋白
本节描述为识别长 DNA 序列所需的多锌指蛋白的设计策略和构建。
3.2.1 蛋白质设计策略
全新的 6 和 9 锌指蛋白（SplZF6 和 SplZF9 ) 是从转录因子 Sp1 的 3 锌指模体创造出来的（图 5.2 )。通过用 Kriippel 型连接子连接 2 或 3 个 Spl 锌指结构域，构建出了这些蛋白质（见注 1 和注 2)。
3.2.2 Sp1ZF6 和 Sp1ZF9 基因的构建
编码 Sp1 的 3 锌指区域的基因 [pUC-Spl ( 530~623) ] 按如先前描述过的步骤构建 [9] 。
( 1 ) 合成编码 Kriippel 型连接子（TGEKP ) 的一段寡核苷酸（84 bp) 为 BamHI/Sty I 片段，并将其插入 pUC-Spl (530~623) 。
( 2 ) 切出 Eco47 III 片段（264 bp) ，并将其插入简单降解过的 pUC-Sp1 (530~623) 中。改变后的质粒重新命名为 pUC-Sp1ZF6。
( 3 ) 用 Agel 位引物对，即用 5'-ACCGGTGAAAAACCGCATATTTGCCACATAC-3' 为编码链，并用 5'-CGGTTTTTCACCGGTGTGGGTCTTGATATG-3' 为非编码链，将两个 AgeI 位分别连接到编码 SplZF9 的中间基因的 5' 端和 3' 端。
( 4 ) 把得到的用 Agel 修饰过的片段连接到 pUC-SplZF6 的 AgeI 位置。连接 2 或 3 个 Spl 片段间的 AgeI 酶切位点编码氨基酸 TG，它是连接肽 TGEKP 的一部分。
( 5 ) 用 DNA 测序确认所有序列。
( 6 ) 作为 BamHI/Styl 片段切出 SplZF6 和 SplZF9 的 DNA 片段，并将其插入简单降解过的质粒 pEV-3b 中（见 3.1 .1；参考文献 [10] ) 。
3.3 DNA 弯折锌指蛋白
3.3.1 和 5.3.3. 2 节描述 DNA 弯折锌指的设计和构建。
3.3.1 蛋白设计步骤
通过连接 SP1 的 2 个 3 锌指，构建出了新的 6 锌指蛋白，包括多聚甘氨酸连接子、 SplZF6 (Gly)4、SplZF6 (Gly)7 (图 5.3 ) 和 SplZF6 (Gly)1。交换 SplZF6 的 TGEKP 和 (Gly)n（n =4、7 或 10 ) 连接子，可以构建 SplZF6 (Gly)n ( 见注 3 和注 4)。
3.2 SplZF6 (Gly)n 的构建
包含有连接序列的合成寡聚核苷酸 A flll/Mfel 是从 Amer sham Biosciences 购置的。经过退火，这些寡聚核苷酸片段被插入到 pUC-Sp1ZF6 载体中。这样得到的质粒被重新命名为 Sp1ZF6 (Gly)n ( n = 4 , 7 或 10)。这些编码蛋白质的 DNA 片段在 Bam HI 和 Eco RI 位点被剪切下来，然后插入一个被同样酶切的质粒，pEV-3b (见 5. 3.1 .1；参考文献 [ 11 ])。
3.4 (His)4 型锌指蛋白
3.4.1 和 3.4.2 节描述 (His)4 型锌指蛋白的设计技巧、多肽合成和基因构建。
3.4.1 蛋白质设计策略通过对 3 (Cys)2 (His)2 型锌指蛋白 Sp1 做突变 CysHis，创造出了一个新的 (His)4 型锌指蛋白（图 5.4)。实质上，存在（Cys)2 (His)2 — 、（Cys)3 (His) — 、 (Cys)4—和（Cys)6 —锌指蛋白（见注 5)。
3.4.2 (His)4 型锌指结构域的多肽合成
合成 3 锌指 Sp1 之中指的（His)4 突变多肽（H4Sp1f2 )，在 Rink 氨基树脂上用 9-芴甲氧羰基固相合成。肽链在 Shimadzu PSSM-8 合成仪上采用苯并三唑-1- 基氧 3 四氢吡咯磷、六氟合磷酸、（PyBOP) -1- 羟基苯并三氮唑 、（HOBO - N-甲基吗磷啉、 (NMM ) 耦合系统标准工艺合成。被保护起来的 H4Sp1f2 肽树脂，用三氟乙酸和乙醇 ( 95 : 5 ) 在室温下处理 2 h，接着用高效液相色谱在 μBondesphere4C4-300 (19 X 50 mm) 柱上纯化。产物的可靠性用飞行时间质谱（Kratos Kompact MALDI4 ) 验证。
3.4.3 H4Sp1 的构建
(His)4 突变体 H4Sp1 通过将 Sp1 的 3 锌指结构域的 6 个半胱氨酸突变为组氨酸构建。 编码（His)4 的 DNA 片段，从 pUC-Sp1 (530-623) 用基于点突变的聚合酶链反应（PCR ) 得到，并且用 GeneRapidDNA (Amersham Biosciences ) 测序仪验证。扩增的片段用 BamHI 和 Eco RI 切割后，插入简单降解过的 pEY-3b 中（见 3.1.1; 参考文献 [12])。
3.5 AT 识别锌指蛋白
识别 AT 的锌指的设计和构建分别在 3.5.1 和 3.5.2 节中描述。
3.5.1 蛋白质设计策略
(Cys)2 (His)2 型锌指蛋白 Sp1 中的 3 锌指结合于富含 GC 的序列，而 6 (Cys)2(His)2 型锌指蛋白 CF2- II 中的 3 锌指（4~6 指）结合于富含 AT 的序列。新的与 AT 富集序列结合的锌指蛋白，用交换这两个类型的锌指蛋白的螺旋来合成（图 5.5)。
3.5.2 Sp1HM 的构建
制备编码 CF2- II 的 α 螺旋的寡核苷酸。基于 PCR 的点突变，用 pUC-Sp1 ( 530~623 ) 作为模板来逆行。PCR 扩增的突变片段用 Bam HI 和 Eco RI 降解后，插入简单地降解过的 pEV-3b 质粒中（见 3.1.1；参考文献 [13])。
来源：丁香实验
