师兄精选：免疫组化攻略集锦（二）

接上一期 师兄精选：免疫组化菜鸟攻略（一），本期我们再聊聊免疫组化（我比较随性，想到哪写到哪）

首先，先介绍下免疫组化一般操作流程：

1. 石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(PH7.4)冲洗三次，每次5分钟。

2. 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。

修复方式：我采用压力锅进行抗原修复，取一定量的修复液于压力锅中，加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于不锈钢或耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，盖 上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷气，从喷气开始计时，2分钟后，压力锅离开热源，冷却至室温（也可以稍冷后，在自来水龙头下加速冷却）。取出玻片，先用 蒸馏水冲洗两遍（用蜡在组织周围划圈，防止抗体跑散，但圈要大一点），之后用PBS（PH7.4）冲洗三遍。每次5分钟。点这里→ 阅读全文

但是在操作过程中，一些同学总会提出出现各种各样的问题

提出几个经常会问到的问题

1.脱蜡至水：二甲苯I II 各10分钟后 100% 95% 85% 75%酒精各多久呢？

2.只搞一个浓度的酒精如95%时间稍微长一些可以吗？

3.抗原修复：可以枸橼酸加热至沸腾再放入切片保温 5-10 分钟吗?冷却至室温这步可以将切片拿出来冷吗?

4.加一抗后37度2-3小时这步要怎么操作,切片怎样放在水浴箱呢?

5.DAB用前几天的可以吗?一定要现用现配吗?

限于篇幅，我将余下的问题以及对问题的回答留在了这里→ 阅读全文

接下来，再来谈谈免疫组化中出现的非特异性背景染色问题以及响应的控制手段

非特异性背景染色问题

一、非特异性染色的识别

他常出现在组织边缘、胶原纤维及血浆渗出处，坏死组织及固定不良的组织中心处。表现为弥漫性，均匀性的背景染色。也可以是随机分布的阳性反应产物点、团或块状。

二、非特异性染色的原因

1. Ig 与 Fc 受体结合

多见于冰冻切片（特别是淋巴造血组织，淋巴细胞，单核细胞，组织细胞表面多），主要是和二抗反应，因为一抗一般稀释度均较大，因此Fc受体的干扰基本不存在。由于福尔马林固定破坏了大部分的Fc受体，所以石蜡切片不多见。

限于篇幅，更多出现的问题以及解决方案留在了这里→ 阅读全文

片子分析问题

当我们把完美的片子做好后，上机分析时，又一个新问题出来了，这玩意儿怎么处理，怎么分析。不要紧接着往下看。

在处理免疫组化图片的问题时，我们都是要采用图像分析软件搞的。

组织上的蛋白表达程度，在图片上表现为免疫染色的深浅及面积大小。用肉眼只能定性地进行判读，最多粗略地作一个主观的分级评价。使用图像分析软件则可以对图片染色的程度作一个定量的测量。这个测量结果与切片上的蛋白表达强度有理论上的线性相关性。所以能客观定量地反映它。

在图像分析的方法中，使用灰度来表示一个点的明暗程度，而图片上一个点的明暗程度是与切片上免疫染色物的“光学密度（OD，Optical Density ）”决定的，再往下追踪一步，就是与组织切片上这个点的蛋白表达程度决定的。这有点类似于分光光度计的情形，比色皿里液体样品的吸光度与液体中吸光成分的浓度相关，符合朗伯-比尔定律。图片上一个点的光密度则与该点上的蛋白表达程度正相关（近似为正比）。所以测量一个点的光密度值，就是在测量这个点上蛋白表达程度的一个相对的量值。好吧，到这里继续阅读全文吧→ 阅读全文

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