点杂交膜的制备
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当扩增产物是多条带时,用点杂交更合适。通过将PCR 产物固定于尼龙膜和硝酸纤微素膜上,再用标记的探针进行点杂交。点杂交可检测突变DNA的突变类型,而应用于人类遗传病诊断和某些基因的分型。
方法有二:
一是将PCR产物固定至膜上,液相中的探针与其杂交;
二是将多种探针固定于同一膜上不同区域,再与液相中的PCR产物杂交,根据阳性位置即可判断产物的类型。
1.PCR产物的固定
[试剂与配置]
TE缓冲液
变性液:0.4mol/L NaOH,25mmol/L EDTA
[操作方法]
(1)按点样器的大小裁减尼龙膜,并作好标记(在一角剪去一块),去离子水中浸泡1min;
(2)5~20μl(50~100ng)PCR产物中加入100μl变性液混匀,室温作用5min;
(3)小心将预湿的膜置于点样器上,注意接触面不能有气泡,预抽5min;
(4)每孔中加入样品后,抽吸5min,再加100μlTE洗涤每孔,抽干水分;
(5)取下膜,置于滤纸上渍干;
(6)渍干的膜于80℃真空干烤1h或于离紫外灯10cm处照射3min,使DNA固定于膜上;可立即使用或保存于塑料袋中。
2.探针的固定
寡核苷酸探针较难固定于膜上,需将其用末端转移酶加poly dT尾后,经UV照射(可激活胸腺嘧啶与尼龙膜上的氨基结合)后固定于尼龙膜上。
[试剂与配置]
10×TdT缓冲液:1mol/L二甲砷酸钾,250mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 10mmol/LcaCl, 2mmol/L DTT。
dTTP.
10mmol/L EDTA
0.3mol/L NaOH
2.5mol/L乙酸铵
6×SSC
0.5% SDS
[操作方法]
(1)在一微量离心管中依次加入:寡核苷酸探针100~200pmol,10×TdT缓冲液10μl,dTTP 100nmol,TdT 60U,补去离子水至100μl,混匀后短暂离心,37℃保温60min;
(2)加入100μl 10mmol/L EDTA终止反应,可取小量在聚丙烯酰胺凝胶电泳中检查加尾长度(400个以上为佳);
(3)用0.3mol/L NaOH室温处理6pmol加尾探针5min,再用2.5mol/L乙酸铵中和;
(4)加入等体积的6×SSC;
(5)将用6×SSC预湿的膜固定于点样器上,点样方法同前;
(6)小心取下膜,置于TE缓冲液饱和的滤纸上,DNA面向上,紫外灯下固定5min;
(7)将固定的膜置于100ml 6×SSC/0.5%SDS溶液中,42~55℃漂洗30min;可立即用于杂交,也可以在蒸馏水中浸洗,晾干后室温保存。