质粒大量提取-SDS裂解法

本法[根据Godson和Vapnek(1973)的方法修订而成]的产量要低得多，但却比本章所述的其他方法更温和，是提取大质粒(大于15kb)的首选方法。

试验步骤:

1、将500ml细菌沉淀物洗过后重悬于10ml用冰预冷的10%蔗糖、50mmol/L Tris.Cl(pH8.0)溶液中，将悬液移至30ml的带盖螺口塑料试管[橡树岭(Oak Ridge)型]中。

2、加入2ml新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml，溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]。当溶液的pH值小于8.0时，溶菌酶不能有效地发挥作用。

3、加8ml 0.25mol/L EDTA(pH8.0)，将管倒置数次以混匀悬液，在冰上放置10min。

4、加4ml 10% SDS，用玻棒迅速混匀内容物，使SDS均匀分散到整个细菌悬液中，操作应尽可能温和小心，以便最大限度地避免释放出来的DNA受到剪切。

5、立即加入6ml 5mol/L NaCl(终浓度为1mol/L)，再次用玻棒温和彻底地混匀内容物，在冰上放置至少1h。

6、以4℃【用Beckman Ti50型转头(或与其相当的转头)】，30 000rpm离心30min，小心将上清转移到一个50ml的一次性塑料离心管中，弃去沉淀物。如果细菌碎片未能全部除尽，可用35 000rpm再离心20min，将上清转移到另一管中，去掉存在离心管内的粘稠状液体。

7、上清分别用酚/氯仿和氯仿各抽提1次。

8、将水相转移到250ml的离心瓶中，于室温加入2倍体积的(约60ml )乙醇，充分混匀，室温下放置1-2h。

9、以4℃，5000rpm离心20min，回收核酸。

10、离心管倒置于纸巾上，使最后残存的乙醇流干，在真空干燥内短时间干燥沉淀物，但不要使之完全干燥。

11、用3mlTE(pH8.0)溶解DNA。