免疫印迹试验（western blot）异常结果分析
丁香通
蛋白质印迹是一种非常适用于蛋白质检测的技术，因为它允许用户量化蛋白质表达。本文主要介绍一些该技术结果异常的排除方法。因为研究人员试图获得一种非特异性但强烈的信号，蛋白质印迹可以被视为一种错综复杂的平衡。
即使蛋白质印迹的程序很简单，也会出现许多问题，导致意想不到的结果。该问题可分为五类：（1）异常或意外的条带，（2）无条带，（3）微弱条带或弱信号，（4）印迹背景高，（5）斑点或不均匀斑点污点。
不寻常或意外的条带可能是由于蛋白酶降解，其在意外位置产生条带。在这种情况下，建议使用保存在冰上或改变抗体的新鲜样品。如果蛋白质位置太高，那么重新加热样品可以帮助打破四元蛋白质结构。类似地，模糊带通常由转移期间存在的高压或气泡引起。在这种情况下，应确保凝胶在较低电压下运行，并且适当地制备转移夹层。此外，更改运行缓冲区也可以解决问题。由于低阻力，非平坦带可能是由于穿过凝胶的过快而导致的。为了解决这个问题，应优化凝胶以适合样品。
另一个问题：由于与使用的抗体，抗原或缓冲液有关的许多原因，也不会出现条带。如果使用不正确的抗体，无论是原发还是继发，该频段都不会显示。此外，抗体的浓度也应该是合适的。如果浓度太低，信号可能不可见。重要的是要记住一些抗体不能用于蛋白质印迹。没有可见条带的另一个原因是抗原浓度最低或不存在。在这种情况下，来自另一来源的抗原可用于确认问题是在于样品还是与其他元素如抗体有关。此外，长时间洗涤也会降低信号。缓冲区也可能导致问题。应该确保缓冲区，如转移缓冲区，TBST，运行缓冲区和ECL都是新的和非污染的。如果缓冲液被叠氮化钠污染，它可以使HRP失活。
同样，弱信号可由低浓度的抗体或抗原引起。增加曝光时间也有助于使频段更清晰。另一个原因可能是脱脂奶粉掩盖了抗原。在这种情况下，使用BSA或减少使用的牛奶量。
高背景通常由过高浓度的抗体引起，其可以与PVDF膜结合。另一个问题可能是缓冲区太旧了。增加洗涤时间也有助于减少背景。太高的曝光也会导致这个问题。因此，建议检查不同的曝光时间以获得最佳时间。
印迹上的斑点和不均匀斑点通常是由于转移不当引起的。如果凝胶和膜之间夹有气泡，则膜上会显得更暗。使用振荡器进行所有孵育也很重要，因此在孵育期间不会出现不均匀的搅动。再一次，洗涤对洗涤背景也是至关重要的。这个问题也可以由与阻断剂结合的抗体引起; 在这种情况下，应该尝试另一种阻止剂。过滤封闭剂也有助于去除一些污染物。最后，这个问题也可能是由二抗的聚集引起的。在这种情况下，应将二抗离心并过滤以除去聚集的抗体。
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