双荧光素酶报告基因实验的一些影响因素及注意

1．报告基因检测受多种因素影响（载体状态、细胞状态、转染量、转染效率、裂解效率、加样精度、检测过程等），因此同批次样品检测值也可能出现浮动。所以实验一般需要做3个或3个以上复孔，并且引入另一个报告基因作为内参。

2．细胞培养时间不宜过长，12-36h内最好；长时间培养后，细胞难裂解。

3．双荧光素酶报告基因的载体选择：

a)萤火虫荧光素酶建议选取pGL-3或pGL-4的载体或自己构建相应的载体；

b)海肾荧光素酶建议选取phRL-TK或pGL-4代载体或自己构建相应的载体。建议海肾载体不使用强启动子（如SV40、CMV），而选用中等强度的启动子（如TK）。

4．双荧光素酶报告基因的载体比例：根据实验具体情况调整。建议作一个预实验来调整（萤火虫载体与海肾载体比例分别用1：10、1：20、1：50、1：100），萤火虫荧光素酶检测发光值大于海肾荧光素酶发光值的比例较好。

5．最适反应温度：室温（20-22℃）。各个组分（细胞裂解产物，底物工作液等）都需要调整到室温。

6．双荧光素酶反应体积：20ul（细胞裂解产物）-100ul（萤火虫荧光素酶底物）-100ul（海肾荧光素酶底物），底物量可根据实际情况调整，但一定要保证底物过量，不然会造成检测结果出现大的偏差

7．细胞裂解产物存放：常温不超过6小时；-20℃一个月；-80℃半年

8．裂解产物与底物混合（手动加样）：要求混合快速、混合时间一致，避免荧光素酶衰变的影响。

9．发光半衰期：

a)单荧光素酶检测试剂盒（E1500），萤火虫荧光素酶的发光半衰期约12min

b)双荧光素酶检测试剂盒（E1910），萤火虫荧光素酶的发光半衰期约9min，海肾荧光素酶的发光半衰期约2min

10．检测结果

检测前应检测孔板或空管的发光值，作为仪器发光背景值，Modulus多功能检测仪的仪器背景值应小于100；

样品检测发光值应该远大于仪器背景值，例如10000。如果样品发光值过于接近仪器背景值，说明样品中荧光素酶过少，需要考虑转染量、转染效率、裂解效率等因素。

(责任编辑：大汉昆仑王)